Диссертация (1091769), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Возможным объяснением большего сродства амидированныхGHRP является положительный заряд амидной группы, что подтверждаетсярезультатами работы [169] по изучению влияния структуры на активность двухпроизводных грелина, С-конец одного из которых был модифицированаминоэтиламидом. Пептид с дополнительным положительным зарядом обладалактивностью,сопоставимойснативнымпептидом,чтоподдерживаетпредположение об участии положительного заряда на С-конце молекулы вузнавании агониста рецептором.92Relative abundanceARelative abundanceRelative abundanceRelative abundanceNL: 1.09E9RT: 17.86RT: 17.86БGHRP-1RT: 18.76NL: 1.55E9GHRP-1m/z = 478.2505 (0.0)m/z = 478.2504 (-0.21)RT: 18.79NL: 3.48E8GHRP-1 (1-7) OHNL: 5.65E7GHRP-1 (1-7) OHm/z = 478.7428 (0.63)m/z = 478.7423 (-0.4)NL: 3.00E4Relative abundanceRelative abundanceRT: 18.04NL: 1.07E5GHRP-1 (1-7) OHдезаминированныйGHRP-1 (1-7) OHдезаминированныйm/z = 479.2297-479.2393m/z = 479.2297-479.2393RT: 17.86RT: 17.79NL: 6.15E8GHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (2-7) NH2m/z = 442.7309 (-2.26)RT: 18.94NL: 6.63E8m/z = 442.7314 (-1.13)RT: 18.97NL: 3.77E8GHRP-1 (2-7) OHNL: 2.31E7GHRP-1 (2-7) OHm/z = 443.2230 (-2.0)m/z = 443.2233 (-1.35)NL: 2.44E3NL: 2.05E4GHRP-1 (2-7) OHдезаминированныйGHRP-1 (2-7) OHдезаминированныйm/z = 443.7116-443.7204m/z = 443.7116-443.7204Рисунок 16 — Масс-хроматограммы по точным массам ионов-прекурсоровGHRP-1 и его деамидированных метаболитов GHRP-1 (1-7) OH и GHRP-1 (27) ОН, а также деамидированно-дезаминированных метаболитов GHRP-1 (17) OH и GHRP-1 (2-7) ОН, полученные при анализе инкубационных смесей сS9 фракцией печени и рекомбинантной амидазой (А) и контрольнойинкубационной смеси с S9 фракцией печени без инкубации с рекомбинантнойамидазой (Б)933.1.4 Выбор оптимальной in vitro модели моделирования процессовбиотрансформации пептидных соединений в организме человекаОсновными критериями при выборе оптимальной in vitro модели являютсялегкодоступность, дешевизна, простота протокола эксперимента, количество иразнообразие метаболитов.
Эксперименты с протеолитическими ферментамипоказали, что использование одной или набора нескольких коммерческидоступных протеаз для моделирования метаболизма является нецелесообразным ввиду их высокой стоимости, больших время- и трудозатрат и зависимостирезультата эксперимента от ряда других факторов. В ходе экспериментов сиспользованием сыворотки крови и субклеточных фракций печени и почекчеловека получено большее количество метаболитов (Таблица 10).Таблица 10 — Общее количество идентифицированных метаболитов приинкубации с сывороткой крови человека и субклеточными фракциями печени ипочек человекаСывороткакровиS9 фракцияпеченичеловекаМикросомальнаяфракция печеничеловекаМикросомальнаяфракция почекчеловека25582361Общееколичествоидентифицированныхметаболитов GHRPДиаграммысоотношенияплощадейвыделенныхионовисходныхсоединений и их метаболитов (относительно самого интенсивного) такжепозволяют наглядно оценить биотрансформирующий потенциал модельныхсистем с использованием сыворотки крови человека и субклеточных фракций(Рисунок А1, Приложение).Сывороткакровиявляетсянаиболеелегкодоступнымнаборомпротеолитических ферментов из всех рассмотренных в данной работе дляизучения метаболизма in vitro.
Дополнительным преимуществом сывороткиявляется отсутствие необходимости добавления каких-либо кофакторов винкубационную смесь. Однако, как показано, при инкубации GHRP с сывороткой94крови количество типов метаболитов, образованных в результате гидролизапептидных связей, невелико. Таким образом, сыворотка крови обладает меньшимразнообразием химических реакций по сравнению с другими изученнымисубклеточными фракциями.Наибольшее количество метаболитов образуется при использовании S9фракции печени и микросом почек человека.
Помимо гидролиза пептидныхсвязей,основнымнаправлениембиотрансформацииGHRPявляетсядезамидирование С-концевого аминокислотного остатка. Также, дезамидированиев незначительной степени было отмечено среди образовавшихся метаболитов приинкубации с микросомальной фракцией печени. Таким образом, наиболееэффективными in vitro моделями метаболизма GHRP признаны человеческиепочечная микросомальная и печеночная S9 фракции.Помимо возможности изучать метаболизм соединений без участияволонтеров и животных, что требует одобрения этического комитета, модельныесистемы in vitro применяются в антидопинговом контроле для полученияреференсных стандартов метаболитов взамен референсных метаболитов вобразцах биожидкостей волонтеров после приема препаратов [124,126].
Однакомодельные системы in vitro представляют собой набор ферментов определенногооргана или ткани и не отражают вклад всего человеческого организма вметаболизм соединения [170]. Поэтому следующим этапом работы былопроведение оценки релевантности выбранных модельных систем in vitro путемсравнения с идентифицированными метаболитами в экспериментах in vivo.3.1.5 Идентификация in vivo метаболитов GHRP в моче человека посленазального приема пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина иипаморелинаЭффективность назального способа приема GHRP была ранее доказана вработах с участием грызунов [171], детей [172] и волонтеров [173,174].
Назальныйспособ приема является не инвазивным, что делает его одним из наиболеепривлекательных способов введения GHRP среди спортсменов [5].95В настоящее время для стимулирующей терапии при дефиците ГР разрешентолько GHRP-2 на территории Японии. Данные по его метаболизму in vivo вчеловеческом организме получены при внутривенном введении, после назальногои перорального приемов [7,147,175]. В работах [147,175] после внутривенноговведения 100 мкг пралморелина дигидрохлорида (GHRP-2) десяти волонтераммужскогополавмочеидентифицированметаболитGHRP-2 (1-3) ОН,соответствующий первым трем N-концевым аминокислотам GHRP-2. При анализеобразцов мочи через 20 ч после перорального приема 100 мкг GHRP-2 также былидентифицированметаболитGHRP-2 (1-3) ОНприотсутствииисходногосоединения [7].В работах [6,116] представлены данные по изучению метаболизмасоединений класса GHRP in vivo путем анализа мочи крыс после внутривеннойинъекции пептидов.
В работе [116] подробно описан метаболизм GHRP-2 суказанием амидированного и деамидированного метаболитов GHRP-2 (1-3) NН2 иGHRP-2 (1-3) ОН, соответственно. При анализе GHRP и их основных метаболитовв сыворотке крови авторы работы [6] описали амидированные метаболиты GHRP1 (2-7) NН2 и GHRP-1 (3-7) NН2, GHRP-6 (2-6) NН2 и GHRP-5 (2-5) NН2. Изпредставленных данных очевидно, что информации о метаболизме GHRP in vivoнедостаточно для четкого предсказания образующихся их метаболитов ворганизме человека.В нашем исследовании принимали участие 5 здоровых волонтеровмужского пола европеоидной расы, которым назальным способом вводили одиниз пептидов (GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин).
Объектомисследования была моча волонтеров, собранная разово до введения препарата и втечение 48 ч после приема. Детали приема пептидов описаны в разделе 2.4.6.1.Подробное описание пробоподготовки и анализа образцов мочи хроматомассспектрометрическими методами приведено в разделах 2.4.4.1 и 2.4.1–2.4.2,соответственно. Концентрации растворов калибровочной прямой составляли 0.1,0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 и 10.0 нг/мл.96При анализе проб мочи после приема GHRP-2 методом наноВЭЖХ-МСВРидентифицированы 2 метаболита: описанный ранее метаболит GHRP-2 (1-3) ОН идеамидированный метаболит GHRP-2 (1-6) ОН, интенсивность сигнала которогобыла примерно в 10 раз ниже, чем исходного пептида.
Деамидированныйметаболит GHRP-2 (1-6) ОН не был детектирован ранее после внутривенногоприема волонтерами монголоидной расы [147]. Причинами этого могут быть инойпуть введения и расовые особенности метаболизма у волонтеров монголоидной иевропеоидных рас. Однозначно установить это можно в исследовании с большимчислом добровольцев. Только один из двух идентифицированных метаболитовбыл признан диагностически значимым. Деамидированный метаболит GHRP-2 (16) ОН характеризовался низкой интенсивностью сигнала и детектирование егодвухзарядного иона масс-спектрометром низкого разрешения затруднительноввиду совпадения значения m/z первого изотопа двухзарядного иона со вторымизотопом двухзарядного иона-прекурсора исходного соединения.
Более того,ранее показано [147,175], что метаболит GHRP-2 (1-3) ОН детектируется в мочедольше, чем исходное соединение. Это стало дополнительным основанием дляего включения как диагностически значимого в разрабатываемую методикуопределения метаболитов GHRP.При анализе проб мочи после приема GHRP-6 помимо исходногосоединения идентифицировали два его деамидированных метаболита GHRP-6 (16) ОН, GHRP-6 (2-6) ОН, GHRP-6 (2-5) ОН и GHRP-6 (2-6) NH2. Согласнополученным данным, GHRP-6 экскретировался в основном в неизменном виде,интенсивность сигнала детектированных метаболитов по сравнению с исходнымсоединением была ниже в 10–50 раз.
Таким образом, аналогично GHRP-2,злоупотребление GHRP-6 можно определить идентификацией характеристичныхионов исходного соединения. В то же время, присутствие метаболитов в образцеможет быть использовано в качестве дополнительного доказательства приемадопинга, а также может указывать предположительное время после приемапептида. С учетом использования масс-спектрометра низкого разрешения привыполнениирутинныханализовв97качестведиагностическизначимыхметаболитов были выбраны метаболиты GHRP-6 (2-6) NH2 и GHRP-6 (2-5) ОН.ДеамидированныйметаболитGHRP-6(2-6) ОНдетектированметодомнаноВЭЖХ-МС/МС в следовых количествах, возможно, из-за его более слабойионизации в режиме положительной ионизации ввиду отсутствия дополнительнойNH2-группы на С-конце.Анализ проб мочи после приема гексарелина и ипаморелина показалинтенсивный метаболизм этих препаратов с образованием деамидированныхметаболитовгексарелин (1-6) ОНиипаморелин (1-5) ОНиметаболитов,образованных протеолитическим гидролизом пептидных связей гексарелин (25) ОН, гексарелин (1-3) ОН и ипаморелин (1-4) ОН, соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
