Диссертация (1091769)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Федеральное государственное бюджетное учреждение«Антидопинговый центр»На правах рукописиЗверева Ирина ОлеговнаПрогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона ростав организме человека для разработки методики их определенияв целях антидопингового контроля02.00.10 – биоорганическая химия02.00.02 – аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучные руководители:к.б.н. Кротов Г.И.к.х.н., доц. Ефимова Е.А.Москва – 2017СодержаниеВведение ........................................................................................................................... 5Цели и задачи исследования ..........................................................................................

7Научная новизна работы................................................................................................. 8Теоретическая и практическая значимость работы ..................................................... 9Положения, выносимые на защиту ............................................................................. 10Степень достоверности и апробация работы ............................................................. 10Личный вклад автора ....................................................................................................

10Структура и объем работы ........................................................................................... 10Глава 1. Литературный обзор ....................................................................................... 111.1 Гормон роста и его секретагоги.......................................................................... 111.1.1 Физиологическое значение гормона роста.................................................. 121.1.2 Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста .............

131.1.3 Грелин и его рецептор ................................................................................... 141.1.4 Рилизинг-пептиды гормона роста ................................................................ 151.2 Особенности метаболизма химически-модифицированных и синтетическихбелков и пептидов ...................................................................................................... 191.2.1 Замена аминокислот (использование D-, β- и ненатуральныхаминокислот) ...........................................................................................................

201.2.2 Замена пептидной связи (псевдопептиды) .................................................. 291.2.3 Изменение N- и C-концевых частей молекулы ........................................... 361.3 Методы изучения метаболизма соединений пептидной природы ..................

401.3.1 Биологические модели изучения метаболизма ........................................... 401.3.2 Аналитические подходы идентификации метаболитов ............................. 421.4 Методы определения GHRP и их метаболитов в допинг-контроле ............... 451.4.1 Хроматомасс-спектрометрические методы ................................................

451.4.2 Метод конкурирующего связывания лигандов с рецептором грелина .... 54Глава 2. Экспериментальная часть .............................................................................. 562.1 Химические реактивы и материалы ................................................................... 562.2 Основное оборудование ...................................................................................... 572.3 Вспомогательное оборудование ......................................................................... 5822.4 Методика эксперимента ......................................................................................

582.4.1 наноВЭЖХ-МСВР анализ GHRP и их метаболитов .................................. 582.4.2 СВЭЖХ-МС/МС анализ GHRP и их метаболитов ..................................... 602.4.3 Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro ........................................... 602.4.4 Пробоподготовка проб мочи методом ТФЭ................................................ 632.4.5 Пробоподготовка проб сыворотки крови .................................................... 652.4.6 Изучение метаболитов GHRP в образцах мочи и сыворотки крови послеприема препаратов здоровыми добровольцами...................................................

66Глава 3. Результаты и обсуждения .............................................................................. 693.1 Сравнение различных in vitro и in vivo моделей метаболизма синтетическихдопинговых соединений пептидной природы......................................................... 693.1.1 Протеолитические ферменты ....................................................................... 693.1.2 Сыворотка человеческой крови .................................................................... 783.1.3 Субклеточные фракции ................................................................................. 843.1.4 Выбор оптимальной in vitro модели моделирования процессовбиотрансформации пептидных соединений в организме человека ................... 943.1.5 Идентификация in vivo метаболитов GHRP в моче человека посленазального приема пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина иипаморелина ............................................................................................................

953.2 Разработка и валидация методики определения GHRP и их метаболитов впробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС ................................................................ 1013.2.1 Выбор сорбента для ТФЭ ............................................................................ 1013.2.2 Выбор способа доведения рН .....................................................................

1053.2.3 Валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробахмочи методом СВЭЖХ-МС/МС .......................................................................... 1073.3 Апробация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочиметодом СВЭЖХ-МС/МС ....................................................................................... 1123.3.1 Количественная оценка наиболее интенсивных и долгоживущихметаболитов GHRP в образцах мочи ..................................................................

1123.3.2 Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформациюсоединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назальногоприема GHRP-6 ..................................................................................................... 115Заключение ..................................................................................................................

1253Выводы ......................................................................................................................... 128Благодарности .............................................................................................................. 130Список условных обозначений и сокращений ......................................................... 131Список литературы ..................................................................................................... 135Приложение ................................................................................................................. 1584ВведениеВ современном мире год от года растет значение побед на крупнейшихмеждународныхспортивныхтурнирах.Победаявляетсянетолькопрофессиональной целью атлетов, но и входит в интересы государства длядемонстрации превосходства, мощи и национального престижа [1].

Радидостижения высоких спортивных результатов используются самые последниенаучныеразработкидляпроизводства:одежды,спортивныхснарядов,специального питания и эксклюзивных медицинских препаратов [2]. Одним изостро стоящих вопросов современного спорта является применение допинга. Отспортсменов, с одной стороны, требуют высоких результатов, а с другой стороны,соблюдения правил честной игры (Fair-play), игры без допинга. На фонеужесточенияантидопинговыхантидопинговогоагентстваправил(ВАДА)ЗапрещенныйежегодносписокпополняетсяВсемирноговсеновымивеществами и методами.Гормон роста (ГР) является одним из «скандально» известных допинговыхпрепаратов.

Увеличение концентрации ГР способствует росту мышечной икостной ткани, уменьшению жировой прослойки, ускоренному заживлению ран иускорению восстановления работоспособности [3]. Перспективы использованияГР в качестве допинга описаны еще в 1982 году Даном Дюшаном в публикации«Wow – GH is amazing» в книге «Подпольное руководство по стероидам»(«Underground Steroid handbook», Dan Duchaine).

После нескольких инцидентовприема препаратов ГР, он включен в Запрещенный список в 1989 году, несмотряна отсутствие официально принятого метода определения [3,4]. ГР, как и вселекарственныепрепаратыпептиднойприроды,характеризуетсяпротеолитической нестабильностью и низкой биодоступностью, поэтому начинаяс конца XX столетия активно ведутся поиски его аналогов с более простойхимической структурой [5].

Подобными аналогами являются соединения классарилизинг-пептидов гормона роста (GHRP, от англ. Growth hormone releasingpeptides), которые способствуют увеличению концентрации ГР путем стимуляцииего выработки. GHRP включены в Секцию S2 «Пептидные гормоны, факторы5роста, подобные субстанции и миметики» Запрещенного списка ВАДА и должныопределяться антидопинговыми лабораториями. Для идентификации GHRPразработаны методики с использованием высокоэффективной жидкостнойхроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) иконкурирующего связывания в присутствии изотопно меченого природногоагониста грелина (125I-грелин) с рецептором GHS-Ra1, экспрессированного наповерхности клеток HEK-293 [6–9].

В современном антидопинговом контролеприменяетсяселективностью,методВЭЖХ-МС/МС,чувствительностью,характеризующийсяэкспрессностью,высокойнадежностьюиинформативностью, позволяя определять большое количество соединений в ходеодного анализа. Помимо интактных молекул метод позволяет детектироватьметаболиты, что особенно актуально для препаратов пептидной природы ввидуих быстрой деградации в организме человека, часто настолько стремительной, чтоисходное соединение не детектируется в биологических жидкостях уже через 24 чпосле приема.Скоростьвыведенияобразовавшихсяметаболитовможетзначительно превышать время выведения исходных субстанций, поэтомувключение их метаболитов в скрининговые методики может увеличивать окнодетектирования после приема допинга и достоверность их идентификации [5].Однако, в большинстве случаев информация о путях биотрансформации вчеловеческом организме рилизинг-пептидов гормона роста ограничена в виду ихстатуса неразрешенных к приему препаратов.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации