Автореферат (1091768)
Текст из файла
На правах рукописиЗверева Ирина ОлеговнаПрогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона ростав организме человека для разработки методики их определенияв целях антидопингового контроля02.00.10 – биоорганическая химия02.00.02 – аналитическая химияАвторефератдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукМосква – 2017Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Антидопинговыйцентр»Научные руководители:кандидат биологических наук, научный сотрудникФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» Федеральногомедико-биологического агентства РоссииКротов Григорий Ивановичкандидат химических наук, доцент кафедрыаналитической химии им.
И.П. Алимарина институтатонких химических технологий (МИТХТ) Московскоготехнологического университетаЕфимова Юлия АлександровнаОфициальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор, заведующийлабораторией системной биологии Федеральногогосударственного бюджетного научного учреждения«Научно-исследовательский институт биомедицинскойхимии имени В.Н. Ореховича»Згода Виктор Гавриловичдоктор химических наук, заведующая лабораториейаналитической токсикологии Федеральногогосударственного унитарного предприятия «Научноисследовательский институт гигиены, профпатологии иэкологии человека» Федерального медикобиологического агентства РоссииСавельева Елена ИгоревнаВедущая организация:Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанскийгосударственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации.Защита состоится «____»_________________2017 г.
в ___ ч.___ мин. на заседании диссертационногосовета Д 212.131.06 на базе ФГБОУ ВО «Московский технологический университет» по адресу:119571, г. Москва, проспект Вернадского, 86, зал ученого совета (ауд. М-119).С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке на сайте ФГБОУ ВПО «Московскийтехнологический университет» www.mirea.ruАвтореферат разослан «___» _____________ 2017 г.Ученый секретарьдиссертационного совета, к.х.н.______________2ВВЕДЕНИЕГормон роста (ГР) является одним из «скандально» известных допинговыхпрепаратов. Увеличение концентрации ГР способствует росту мышечной и костнойткани, уменьшению жировой прослойки и ускорению восстановленияработоспособности.
Перспективы использования ГР в качестве допинга были описаныеще в 1982 году и после нескольких инцидентов приема препаратов ГР, он былвключен в 1989 году в Запрещенных список, несмотря на отсутствие официальнопринятого метода определения. Как и все лекарственные препараты пептиднойприроды, ГР характеризуется протеолитической нестабильностью и низкойбиодоступностью, поэтому начиная с конца XX столетия активно ведутся поиски егоаналогов с более простой химической структурой.
Подобными аналогами являютсясоединения класса рилизинг-пептидов гормона роста, (от англ. Growth hormonereleasing peptides, GHRP), которые увеличивают концентрацию ГР путем стимуляцииего выработки при связывании с рецептором грелина GHS-Ra1 в гипофизе (Рис. 1).Данные соединения включены в Секцию S2 «Пептидные гормоны, факторы роста,подобные субстанции и миметики» Запрещенного списка Всемирногоантидопингового агентства (ВАДА).GHRP-1GHRP-2GHRP-4GHRP-5GHRP-6алексаморелингексарелинипаморелинAla — His ― (D-β-Nal) ― Ala ―Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2(D-Ala) ― (D-β-Nal) ― Ala ―Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2(D-Trp) ― Ala ―Trp ― (D-Phe)NH2Tyr ― (D-Trp) ― Ala ―Trp ― (D-Phe)NH2His ― (D-Trp) ― Ala ―Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2Ala — His ― (D-Mrp) ― Ala ―Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2His ― (D-Mrp) ― Ala ―Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2Aib — His ― (D-β-Nal)(D-Phe) — Lys — NH2Рисунок 1 — Аминокислотные последовательности наиболее популярныхпредставителей группы GHRPДля идентификации GHRP разработаны методики с использованиемвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной массспектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) и конкурирующего связывания в присутствииизотопно меченого природного агониста грелина (125I-грелин) с рецептором GHS-Ra1,экспрессированного на поверхности клеток HEK293.
В современном антидопинговомконтролеприменяетсяметодВЭЖХ-МС/МС,позволяющийселективноидентифицировать большое количество соединений и их метаболитов в ходе одногоанализа. Препараты пептидной природы в организме человека подвержены быстройдеградации, часто настолько стремительной, что исходное соединение недетектируется в биологических жидкостях уже через 24 часа после приема. Поэтому3особый интерес представляет идентификация метаболитов GHRP, что можетувеличить временное окно детектирования после приема и достоверностьидентификации данного вида допинга. Поскольку многие из GHRP не разрешены кприему человеком, информация о путях их биотрансформации в человеческоморганизме ограничена данными, полученными с использованием моделей in vitro иin vivo в экспериментах на крысах и лошадях. Таким образом, выявлениедиагностически ценных метаболитов GHRP, полученных при использованиирелевантных in vitro моделей и подхода in vivo, является актуальной и важной задачейпри разработке эффективного способа определения GHRP в биожидкостях человека вцелях антидопингового контроля.Цели и задачи исследованияЦель настоящей работы заключается в оценке эффективности прогнозированияобразующихся в организме человека метаболитов GHRP с использованием различныхподходов in vitro и in vivo при разработке эффективного способа качественного ихопределения методом сверхвысокопроизводительной высокоэффективной жидкостнойхроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (СВЭЖХ-МС/МС) дляантидопингового контроля.Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:1.Изучение метаболитов GHRP, полученных с использованием различныхмоделей in vitro: протеолитические ферменты, человеческая плазма крови, микросомыпочек и печени, S9 фракция печени человека.2.Идентификация метаболитов GHRP в моче человека, образовавшихсяin vivo после назального приема волонтерами пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6,гексарелин и ипаморелин.3.Сравнение эффективности изученных моделей in vitro и выявлениеоптимальных для моделирования процессов биотрансформации допинговыхпептидных соединений в организме человека.4.Выбор наиболее интенсивных и долгоживущих диагностически ценныхметаболитов GHRP с целью их мониторинга для определения фактов злоупотребленияданным видом допинга.5.Разработка способа хроматомасс-спектрометрического определенияметаболитов GHRP в образцах мочи человека.
Проведение валидации разработаннойметодикисопределениемследующихметрологическиххарактеристик:селективность/специфичность,пределобнаружения(ПО),линейность,прецизионность в условиях одного дня и между днями, а также оценка степениизвлечения анализируемых соединений и влияния матрицы.6.Апробация разработанного способа для определения временидетектирования GHRP и их метаболитов после приема и оценки влияния4индивидуальных особенностей человеческого организма и разных способов приемаGHRP на их метаболизм после назального и внутривенного введения некоторыхпредставителей этого класса.Научная новизна работыВ диссертации представлены результаты исследования метаболизма GHRP сиспользованием различных in vitro моделей, показана эффективность модельныхсистем in vitro микросомальной почечной и S9 печеночной фракций человека.Выявлены закономерности биотрансформации in vivo 5 наиболее широкоизвестных препаратов GHRP в человеческом организме (для 4 из 5 препаратов –впервые).Наосновеполученныхрезультатовразработанхроматомассспектрометрический способ определения метаболитов GHRP для выявления ипредотвращения использования данного вида допинга в спорте.
Разработаннаяметодика позволяет выявлять случаи злоупотребления GHRP, в том числе быстрометаболизирующими представителями данного класса.Впервые детектирован самый долгоживущий из описанных ранее метаболитовGHRP-1 (2-4) ОН, мониторинг которого позволяет выявлять случаи злоупотребленияGHRP-1, который не обнаруживается в моче в исходном виде.Проведена оценка влияния физиологических особенностей человеческогоорганизма и способов приема на метаболизм GHRP (на примере приема препаратовGHRP-2 и GHRP-6), показана эффективность включения метаболитов вантидопинговую методику.Теоретическая и практическая значимость работыСравнение различных in vitro моделей метаболизма GHRP показало, чтопеченочная S9 и почечная микросомальная фракции человека являются наиболееэффективными моделями для моделирования процессов трансформации биоактивныхпептидов и прогнозирования образующихся в организме человека метаболитов.Детектирование метаболитов после назального введения наиболее популярных GHRP(in vivo метод исследования) позволило оценить выбранную in vitro модельметаболизма и получить сведения о наиболее интенсивных и долгоживущихдиагностически значимых метаболитах.
Полученные данные легли в основу способаопределения исходных веществ и метаболитов GHRP в биологических жидкостяхчеловека. Определение метаболитов GHRP увеличило временное окно детектированияпосле приема допинга и достоверность идентификации, что особенно актуально дляGHRP-1 и алексаморелина ввиду их быстрой деградации. Разработанный способвалидирован в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и внесен вобласть аккредитации (шифр SOP P1.016) Федерального государственного5бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» (ФГБУ АДЦ). Опыт успешногоприменения предложенного способа определения GHRP и их метаболитов позволилспециалистам ФГБУ АДЦ выявить случаи злоупотребления соединениями данногокласса спортсменами.Положения, выносимые на защиту1.Выбор оптимальных моделей in vitro для моделирования процессовбиотрансформации допинговых пептидных соединений в организме человека.2.Выявление наиболее диагностически ценных метаболитов GHRP с цельюих мониторинга.3.Способ определения GHRP и их метаболитов, выделенных из мочичеловека, методом СВЭЖХ-МС/МС.4.Изучение влияния индивидуальных особенностей человеческогоорганизма и разных способов приема GHRP на их метаболизм после назального ивнутривенного введения некоторых представителей этого класса.Степень достоверности и апробация работыОсновные результаты исследования представлены на международныхконференциях: “33rd Cologne Workshop on Dope Analysis (Manfred Donike Workshop)”(Кельн, Германия, 2014), “The 14th HUPO World Congress” (Ванквер, Канада, 2015) иIII Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярныйэлектрофорез» (Краснодар, Россия, 2017).
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
