Автореферат (1091768), страница 4
Текст из файла (страница 4)
откл.,%(intra-day/inter-day)326175563756477779886162134ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %0.50.10.10.050.20.50.50.050.10.50.20.50.20.2СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %3/62/53/41/22/32/32/212/209/1920/211/21/312/1818/210.996ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, нг/мл144755102142221036на планшетах для микроэкстракции0.25 мл мочи/0.25 мл буф.р-ра 0.25 мл мочи/0.25 мл буф.р-рабез упариванияупаривание в токе N2ПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст. откл.,%(intra-day/inter-day)3564816325232668741470576162ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %0.20.050.050.10.10.50.20.050.10.20.10.20.20.2СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %2/23/56/550/503/25/31/11/113/1916/191/23/819/1814/160.981ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, нг/млЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %GHRP-1GHRP-2GHRP-4GHRP-5GHRP-6алексаморелингексарелинипаморелинGHRP-1 (3-7) NH2GHRP-2 (1-3) OHGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-5) OHгексарелин (1-3) OHипаморелин (1-4) OHЛИНЕЙНОСТЬ (общ.)ПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст.
откл.,%(intra-day/inter-day)СоединениеСТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %на картриджах0.5 мл мочи/0.5 мл буф. р-раупариваниеПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, нг/мл1 мл мочиупариваниеПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст. откл.,%(intra-day/inter-day)Условия ТФЭ11/2016/188/124/58/95-66/618/2225/2221/233/62/39/1626/230.97710.10.050.20.2110.050.050.20.10.50.20.05266367555859637170107422142450472573636412041153231425Количественнаяоценканаиболееметаболитов GHRP в образцах мочиинтенсивныхидолгоживущих40.0230.01520.0110.00500101520 25 30Время, ч354045GHRP-2GHRP-2 (1-3) OH70[C]GHRP-2, нг/мл60550440330220Д250652004150310025010005101520 25 30Время, ч354045гексарелингексарелин (1-3)ОН 201401816120141210080108606410401010003007Г6[C]гексарелин, нг/мл53505101520 25 30Время, ч354045[C]GHRP-6, нг/мл0.025GHRP-6GHRP-6 (2-5) OHGHRP-6 (2-6) NH29820005101520 25 30Время, ч3540[C]гексарелин (1-3) ОН, нг/мл5[C]GHRP-6 (2-6) NH2 и GHRP-6 (2-5) ОН, нг/мл0.03[C]GHRP-1 (3-7) NH2, нг/мл0.03560БВ0.04GHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1 (2-4) OH7[C]GHRP-2 (1-3) ОН, нг/млА[C]GHRP-1 (3-7) NH2 и GHRP-1 (2-4) ОН, нг/млДиагностически ценные метаболиты GHRP были включены в СВЭЖХМС/МС анализ.
С использованием синтезированных и изотопно меченыхстандартов способ был оптимизирован и внедрен для использования в целяхдопинг-контроля. Установлены временные окна детектирования наиболееинтенсивных и долгоживущих диагностически ценных метаболитов GHRP-1,GHRP-2, GHRP-6, гексарелина и ипаморелина после назального приема(Рисунок 3).45ипаморелинипаморелин (1-4) ОН5[C], нг/мл4321005101520 25 30Время, ч354045Рисунок 3 — Профили концентраций GHPR и их метаболитов в моче, послеразового назального приема волонтерами: GHRP-1 (А), GHRP-2 (Б), GHRP-6 (В),гексарелин (Г) и ипаморелин (Д)GHRP-2, GHRP-6, гексарелин и ипаморелин характеризуются схожимипрофилями выведения с максимальными концентрациями в течение первых 5 чпосле приема.
Максимальные пики концентраций метаболитов данныхсоединений наблюдаются в течение 5-15 ч после приема. Ипаморелин интенсивнометаболизирует с образованием метаболита ипаморелин (1-4) ОН в сопоставимыхс исходным соединением концентрациях, который детектировался до 37 ч послеприема при отсутствии исходного пептида. Наиболее широкое окнодетектирования имеет GHRP-2, который вместе со своим метаболитом GHRP2 (1-3) ОН детектировался в течение 47 ч после приема пептида.
Изпредставленных графиков очевидно, что выявление злоупотребления GHRP-1возможно только по его метаболитам с пиком максимальной их концентрацийчерез 7.5 ч после приема, среди которых наиболее долгоживущим метаболитомявляется GHRP-1 (2-4) ОН.При сравнении полученных результатов in vitro и in vivo показано, чтоin vivo метаболиты GHRP-1 (3-6) ОН и гексарелин (2-5) ОН не былидетектированы после инкубации с почечной микросомальной и печеночной S9фракциями человека. Данное наблюдение свидетельствует о том, что подходin vitro не является универсальным для прогнозирования образующихсяметаболитов пептидных соединений и не может полностью заменить методыin vivo.
В то же время данный подход позволяет учитывать различныефизиологические особенности организма и способы приема препаратов.Использование системы in vitro также может быть альтернативным подходомполучения концентрированных смесей стандартных образцов метаболитов,которые могут применяться в качестве контрольных образцов вместо проббиожидкостей после приема соединений волонтерами в случае невозможности ихполучения по этическим соображениям.Особенности метаболизма GHRP-2 (после назального и внутривенноговведения) и GHRP-6 (после назального введения)Представленные выше результаты получены на основе небольшой выборкив исследовании, при котором один препарат принимался только однимволонтером. Для оценки влияния на метаболизм физиологических особенностейорганизма и различий способов приема был поставлен эксперимент с большимколичеством участвующих волонтеров.
Исследование выполнено совместно сиспанской антидопинговой лабораторией Barcelona Antidoping Laboratoryинститута Fundació Institut Mar D'Investigacions Mèdiques (IMIM). В экспериментеволонтерам мужского пола вводили пептиды GHRP-2 и GHRP-6 согласно даннымв Таблице 4.18Таблица 4 — Количество участников, способ введения и вводимая доза GHRP-2и GHRP-6Способ введенияGHRP-2822ПриемКонтрольная группаПриемКонтрольная группаВнутривенно (i.v.), 100 мкгНазально, 500 мкгGHRP-6―22Анализ образцов мочи и сыворотки крови после однократноговнутривенного введения 100 мкг пралморелина дигидрохлорида (GHRP-2)показал различные временные сроки определения (Рисунок 4).0,0101015612Время, ч1825102400GHRP-2 вол 1GHRP-2GHRP-2 (1-3) метвол 8 ОНGHRP-2(1-3)В3100,00004[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл220[C]GHRP-2, нг/мл0,02035[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл4GHRP-2GHRP-2 (1-3) ОНметБGHRP-2GHRP-2 (1-3) ОНmet612Время, ч1824GHRP-2 вол 1GHRP-2GHRP-2 (1-3) метвол 7 OHGHRP-2(1-3)Г0,0240,01530,0120,0051030[C]GHRP-2, нг/мл5[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл1600612Время, ч1812208104024[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/млА00612Время, ч1824Рисунок 4 — Профили изменения концентраций GHRP-2 (черным) и егометаболита GHRP-2 (1-3) (серым) в образцах сыворотки крови (А) и мочи (Б)после внутривенного введения 100 мкг пралморелина дигидрохлоридаволонтерам мужского пола (средние значения, n=8).
Индивидуальные профилиизменения концентраций GHRP-2 и его метаболита GHRP-2 (1-3) ОН в образцахсыворотки крови (В) и мочи (Г) волонтеров19Только в одной из восьми проб сыворотки крови волонтеровидентифицирован основной метаболит GHRP-2 (1-3) ОН, в то время как в мочеметаболит GHRP-2 (1-3) ОН детектировали во всех пробах мочи всех волонтеров.После назального приема 500 мкг GHRP-2 метаболит GHRP-2 (1-3) ОНдетектировали во всех пробах мочи и в образцах сыворотки лишь одного из двухучаствующих в исследовании волонтеров.Прианализе проб сыворотки крови волонтеров после приема500 мкг GHRP-6 метаболиты GHRP-6 (2-5) ОН и GHRP-6 (2-6) NH2 выявлены небыли.
Профили изменения концентраций GHRP-2 и его метаболита GHRP-2 (13) ОН в образцах мочи и сыворотки крови после приема 500 мкг GHRP-2 ипрофили изменения концентраций GHRP-6 после приема 500 мкг GHRP-6приведены на Рисунке 5.GHRP-2 вол 1GHRP-2GHRP-2 (1-3) мет вол 2GHRP-2(1-3) OHБнг/мл340,0330,0220,0110(1-3) OH,5[C]GHRP-6, нг/мл0,04[C]GHRP-2[C]GHRP-2, нг/млA612Время, ч1810002024612Время, ч1824Рисунок 5 ― Профили изменения концентраций GHRP-2 и его метаболитаGHRP-2 (1-3) ОН после приема 500 мкг GHRP-2 (А) и GHRP-6 после приема500 мкг GHRP-6 (Б) в образцах сыворотки кровиВлияние индивидуальных особенностей метаболизма волонтеров видно поразличиям профилей изменений концентраций GHRP-2 и его метаболита GHRP-2(1-3) ОН в образцах мочи после приема 100 мкг пралморелина дигидрохлоридаволонтерами и при идентификации следовых количеств метаболита GHRP-2 (13) ОН в образцах сыворотки крови некоторых волонтеров (Рисунки 4 и 5).
Прианализе образца мочи одного из волонтеров детектировали метаболит GHRP-2 (13) ОН, концентрация которого в 3 раза превосходила концентрацию исходногопептида GHRP-2 и временное окно детектирования которого было в 2.5 разабольше. В установленном случае детектирование метаболита GHRP-2 (1-3) ОНимело большую диагностическую ценность по сравнению с его исходнымсоединением. Данное наблюдение подтверждает необходимость включения как20можно большего числа диагностически ценных метаболитов исходныхсоединений для повышения эффективности антидопинговой методики.ЗаключениеПостоянное растущее число биоактивных пептидов с потенциальнымдопинговым эффектом ставит перед антидопинговыми лабораториями все новыезадачи по разработке высокочувствительных способов их идентификации вбиожидкостях спортсменов. По сравнению с низкомолекулярными допинговымисубстанциями препараты белковой природы обладают рядом преимуществ:слабая иммуногенность, высокая специфичность действия, низкая токсичностьобразующихся метаболитов.
Белки и пептиды быстро деградируют в организмечеловека, что делает их еще более привлекательными допинговымисоединениями. Такими соединениями, набирающими популярность средипрофессиональных спортсменов и спортсменов-любителей, являются соединениякласса GHRP.Применяемые на сегодняшний день методики обнаружения различныхдопинговых субстанций предполагают детектирование не только исходныхсоединений, но и их метаболитов и/или маркеров их приема, что значительноможет увеличить чувствительность методик, достоверность идентификации ивременное окно детектирования после приема.В настоящей работе нами представлены данные о наиболее диагностическиценных метаболитах для известных GHRP, полученные с помощью подходовin vitro и in vivo.
По результатам сравнения наборов полученных метаболитовin vitro и in vivo, почечная микросомальная фракция и S9 фракция печеничеловека признаны наиболее эффективными моделями in vitro для симулированияметаболических процессов в организме человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
