Автореферат (1091768), страница 2
Текст из файла (страница 2)
По теме диссертации опубликовано 10печатных работ – 4 статьи в реферируемых научных журналах и 6 в трудахконференций.Личный вклад автораПостановка цели и задач исследования, обобщение литературных данных,проведение научных экспериментов и оценка полученных результатов, подготовка инаписание научных статей в соавторстве выполнены лично автором.Структура и объем работыДиссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, спискалитературы и 1 приложения. Работа изложена на 161 страницах, содержит 23 рисунка,14 таблиц и список цитируемой литературы из 180 наименований.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫОбзор литературыВ обзоре литературы приведены данные об основных подходах увеличениястабильности пептидов и их влиянии на метаболизм соединений, методах изучения6метаболизма соединений пептидной природы и методиках, применяемых дляопределения GHRP и метаболитов в целях антидопингового контроля.Материалы, основное оборудование и методы исследованияМатериалыСтандарты GHRP и их метаболитов синтезированы на заказ фирмой ThermoScientific, Германия, и предоставлены Катрин Гебель (Australian Sports Drug TestingLaboratory, Сидней).
В качестве внутренних стандартов использовали изотопномеченые аналоги GHRP-2 ([13C3;15N1]Ala3-GHRP-2, ВС1) и его метаболит([13C3;15N1]Ala3-GHRP-2 (1-3) NH2, ВС2).Для экспериментов in vitro использовали человеческие рекомбинантныепротеолитические ферменты: рекомбинантная человеческая аминопептидаза N(rhAPN, ЕС 3.4.11.2) и карбоксипептидаза М (rhCPM, EC 3.4.17.1) фирмы R&DSystems, США, карбоксипептидаза В (rhCPB, EC 3.4.17.2) фирмы Sino BiologicalReagents, Китай; бычья почечная микросомальная лейциновая аминопептидаза (LeuAP, ЕС 3.4.11.2) и карбоксипептидаза В (CPB, EC 3.4.17.2) из бычьей поджелудочнойжелезы, предоставленные Sigma-Aldrich, США, эндопептидаза Lys C (ЕС 3.4.21.50)фирмы Promega, США; субклеточные фракции: микросомальная фракция почекчеловека фирмы Celsis, США; микросомальная фракция печени и S9 фракция печеничеловека фирмы BD Biosciences, США.
Дезамидирование исследуемых пептидовпроводили с применением рекомбинантной амидазы фирмы Sigma-Aldrich, США;состав НАДФ-регенерирующего раствора включал дрожжевую глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, приобретенную у Sigma-Aldrich, США.Методология и методы исследованияСВЭЖХ-МС/МС анализ GHRP и их метаболитов проводили на жидкостномхроматографе Ultimate 3000 LS, соединенным с тройным квадрупольным массанализатором TSQ Quantiva фирмы Thermo Scientific, США.наноВЭЖХ-МСВР1 анализ GHRP и их метаболитов проводили с использованиемсистемы нанопотокового хроматографа Dionex Ultimate 3000 LS Nano и массспектрометра высокого разрешения гибридного типа Q Exactive фирмы ThermoScientific, Германия.Метаболиты GHRP с использованием некоторых коммерчески доступныхпротеолитических ферментов получали инкубацией целевых соединений сразличными протеолитическими ферментами в течение 24 ч при 37°С в соотношенияхфермент/субстрат 1:20, 1:50 и 1:100 (по весу).1наноВЭЖХ-МСВР – сверхвысокопроизводительная высокоэффективная нанопотоковая жидкостная хроматография всочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения7Метаболиты GHRP с использованием человеческой сыворотки крови получалиинкубацией 1 мкг каждого пептида в 100 мкл сыворотки в течение 24 ч при 37°С припостоянном встряхивании (400 об./мин).
Для приготовления отрицательных контролейиспользовали сыворотку человеческой крови после термической дезактивацииферментов при 95°С в течение 5 мин.Метаболиты GHRP с использованием человеческих почечной и печеночноймикросомальной фракций и S9 печеночной фракции получали инкубациейсоединений с каждой из субклеточных фракций в течение 24 ч при 37°С и постоянномперемешивании (400 об./мин) в присутствии компонентов НАДФН-регенерирующейсистемы.
В качестве отрицательных контролей анализировали инкубационные смесиисходных пептидов без добавления фермента.Дезамидированные метаболитов GHRP с рекомбинантной амидазой получалиинкубацией целевых веществ с рекомбинантной амидазой в течение 24 ч при 30°С ипостоянном встряхивании (400 об./мин).
В качестве отрицательных контролейанализировали инкубационные смеси исходных пептидов без добавления фермента.Очистку и концентрирование проб мочи осуществляли методом твердофазнойэкстракции на картриджах Oasis®WCX (30 мг, 1 мл) и микропланшетах Oasis®WCX(96 лунок, 2 мг) фирмы Waters Inc., США. Упаривание элюатов проводили с помощьювакуумного упаривателя или в токе азота. Концентраты перерастворяли ианализировали наноВЭЖХ-МСВР и СВЭЖХ-МС/МС методами.Очистку проб сыворотки крови методом твердофазной экстракции осуществлялина картриджах Oasis®HLB (60 мг, 3мл) фирмы Waters Inc., США. Элюаты упаривали сиспользованием вакуумного упаривателя, затем перерастворяли и анализировалиметодом СВЭЖХ-МС/МС.Очистку проб сыворотки крови преципитацией белков осуществляли разбавлениемобразца в 2 раза водой и добавлением ацетонитрила в соотношении 1:4 (по объему) споследующимцентрифугированиемпослетщательногоперемешивания.Супернатанты образцов упаривали с использованием вакуумного упаривателя, затемперерастворяли и анализировали методом наноВЭЖХ-МСВР.Прием препаратов волонтерами осуществлялся:• При изучении метаболитов GHRP в образцах мочи после назального приемасоединений GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина или ипаморелина (5 мкг на 1 кгвеса).
В исследовании приняли участие 5 здоровых добровольцев мужского пола,средние показатели возраста и веса которых составили 39.6 ± 9.9 лет и 90 ± 14.7 кг.Образцы мочи собирали до введения пептидов (пробы бланковой мочи) и в течение848 ч после приема. Протокол эксперимента был одобрен Комиссией побиомедицинской этике Министерства спорта Российской Федерации.• При изучении метаболитов GHRP-2 и GHRP-6 в образцах сыворотки кровипосле назального введения соединений (доза составляла 500 мкг). В исследованииприняли участие 6 здоровых добровольцев мужского пола (по 2 добровольца накаждый препарат и контрольная группа из двух участников эксперимента), средниепоказатели возраста и веса которых составили 38.8 ± 8.0 лет и 81.8 ± 20.5 кг,соответственно. Образцы крови собирали до введения пептидов (пробы бланковойсыворотки) и через 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после приема препарата.• При изучении метаболитов GHRP-2 в образцах мочи и сыворотки крови послевнутривенного введения здоровым добровольцам вводили 100 мкг пралморелинадигидрохлорида (GHRP-2, торговое название GHRP KAKEN100®, KakenPharmaceutical Co., Ltd).
В исследовании приняли участие 10 здоровых добровольцевмужского пола (8 добровольцев приняли препарат, 2 добровольца вошли в составконтрольной группы) в возрасте от 20 до 30 лет, средние показатели индекса массытела и веса которых составили 21.5 ± 3.5 кг/м² и 72.9 ± 8.7 кг, соответственно. Образцыкрови собирали до введения GHRP-2 (пробы бланковой сыворотки) и через 30 мин, 1,1.5, 2, 3, 4, 8 и 24 ч после приема.
Образцы мочи собирали до введения GHRP-2(пробы бланковой мочи) и в интервалах времени, соответствующих 0-1, 1-2, 2-4, 4-6,6-12 и 12-24 ч после приема препарата. Протокол эксперимента был одобренЭтическим комитетом научных исследований Parc Salut Mar в г. Барселона (n°2014/5760).РЕЗУЛЬТАТЫВыбор оптимальных in vitro моделей метаболизма синтетических допинговыхсоединений пептидной природыПротеолитические ферментыПрепараты протеолитических ферментов часто используются для изученияметаболизма различных соединений. В рамках данного исследования ферментыподбирались на основе предположений о вероятности их вовлеченности в процессыдеградации исследуемых пептидов, исходя из субстратной специфичности и тканевойлокализации.Быливыбраныследующиепротеолитическиеферменты:аминопептидаза N, карбоксипептидаза В и карбоксипептидаза М, полученные сиспользованием различных подходов: генно-инженерных и выделенных из биосырья.В зависимости от соотношения количеств протеолитического фермента и субстрата(исходного пептида) в процессе инкубации наблюдали различные наборыметаболитов.
Однако прямой зависимости между соотношением количествапротеолитическогоферментаисубстрата,атакжеспецифичностью9протеолитического фермента и химической структурой исходного соединенияотмечено не было. Также показано, что ферменты катализировали гидролитическоерасщепление связи в одном соединении, но не катализировали протеолиз по этой жесвязи в другом соединении (Рисунок 2).АGHRP-1Lys CrhCPBrhCPMLeu-APrhAPNAla — His ― (D-β-Nal) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2Lys CCPBrhCPBrhCPMrhAPNCPBrhCPBrhCPMrhAPN Lys CrhCPBrhCPMrhAPN(D-Trp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe)GHRP-4NH2Lys CCPBrhCPBrhCPMLeu-APrhAPNrhCPBrhCPMrhAPNrhCPBrhAPNrhCPBrhCPMrhAPNrhAPNrhCPBrhCPMrhAPN rhAPNCPB Lys CrhCPM rhCPBrhAPN rhAPNrhCPBrhCPM rhCPBrhAPN rhAPNLys CrhCPBrhAPNrhCPMLeu-APrhAPNTyr ― (D-Trp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe)GHRP-5NH2Lys CrhAPNHis ― (D-Trp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2GHRP-6CPBrhCPBrhCPMLeu-APrhAPNAla — His ― (D-Mrp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2rhCPBrhAPNHis ― (D-Mrp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2ГексарелинИпаморелинГексарелинCPBrhCPB rhCPBrhCPM rhCPMrhAPN rhAPN(D-Ala) ― (D-β-Nal) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2GHRP-2АлексаморелинLys CrhCPBrhAPNrhCPMrhAPNLys CCPBrhCPBrhCPM rhCPBLeu-AP rhCPMrhAPN rhAPNrhAPN Lys CAib — HisHis ―― (D-β-Nal)(D-Phe) —— Lys(D-Mrp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe)Lys —— NHNH22БLys CCPBCPMLeu-APAPNEC 3.4.21.50EC 3.4.17.2EC 3.4.17.12EC 3.4.11.2EC 3.4.11.2- X-X-K-│-X- X-X-X-│-K- X-X-X-│-R- X-X-X-│-K- X-X-X-│-RA-│-X-X-XA- P-│-X-XA-│-X-X-XA- P-│-X-XРисунок 2 — Аминокислотные последовательности с указанием сайтов расщепленияпротеолитических ферментов (А) и специфические сайты расщепленияиспользованных протеаз (Б)10Корреляции в составе смесей метаболитов, полученных с использованиемферментов одного класса, но выделенных из разных источников, например,рекомбинантной человеческой и бычьей панкреатической карбоксипептидаз В, такжене отмечены.
В экспериментах с применением рекомбинантных человеческихпротеолитических ферментов наблюдали большую протеолитическую активность,заключающуюся в заметном разнообразии полученных метаболитов (Таблица 1).Таблица 1 — Общее количество идентифицированных метаболитов при инкубации снекоторыми коммерчески доступными протеолитическими ферментамиРекомбинантные протеолитическиечеловеческие ферментыОбщееколичествоАминоКарбокси- Карбоксиидентифици пептидаза N пептидаза М пептидаза Врованных(rhAPN)(rhCPM)(rhCPB)метаболитовGHRP231419Бычьи протеолитическиеДругоеферментыПочечнаяПанкреатичесмикросомальнаяЭндокая карбоксилейциноваяпептидазапептидаза ВаминопептидазаLys C(CPB)(Leu-AP)5510Сыворотка человеческой кровиАнализ полученных образцов показал, что протеолитическая деградация –основной катаболический процесс для соединений класса GHRP при инкубации всыворотке крови человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
