Автореферат (1091768), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Присутствие исходных соединений GHRP-1 иалексаморелина в следовых количествах коррелирует с ранее опубликованнымиработами, в которых описана полная деградация данных пептидов с образованиемамидированных метаболитов (GHRP-1 (2-7) NH2, GHRP-1 (3-7) NH2, алексаморелин(2-7) NH2).
Идентификация GHRP-1 и алексаморелина может объясняться высокойчувствительностью методов анализа и/или избытком исходных соединений вреакционных смесях. Нами показано, что для GHRP-1, алексаморелина и GHRP-5превалирует N-концевое направление метаболической деградации, в то время как дляостальных исследованных GHRP – С-концевое.Субклеточные фракции: печеночная микросомальная и S9 фракция, почечнаямикросомальная фракцияВ процессе инкубации GHRP с различными субклеточными фракциямиполучено от 2 до 11 метаболитов для каждого исходного соединения.
Наибольшеечисло метаболитов образуется в процессе инкубации с печеночной S9 и почечноймикросомальной человеческими фракциями (Таблица 2). GHRP, имеющиененатуральные аминокислотные остатки во втором положении, показали большуюустойчивость к воздействию ферментов, в то же время отмечено гидролитическое11расщепление пептидной связи (β-D-Nal)―(D-Trp) ипаморелина с образованиемметаболита ипаморелин (1-3) ОН.Таблица 2 — Общее количество идентифицированных метаболитов при инкубации ссывороткой крови человека и субклеточными фракциями печени и почек человекаОбщее количествоидентифицированныхметаболитов GHRPСывороткакровиS9 фракцияпечени человека2558Микросомальная фракцияпечени человекапочек человека2361В микросомальной фракции почек человека и печеночной S9 фракциидетектированы метаболиты GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, алексаморелина, гексарелина иипаморелина с молекулярной массой большей по сравнению с исходнымисоединениями на 1 Да, в то время как для GHRP-4 и GHRP-5 метаболитыдетектированы не были.
Экпериментальные данные указывали на увеличениемолекулярной массы во всей y-серии фрагментных ионов, что соответствует заменеNH2-группы на ОН-группу С-терминального аминокислотного остатка.С-концевым амидированным аминокислотным остатком GHRP-1, GHRP-2,GHRP-6, алексаморелина, гексарелина и ипаморелина является Lys, в состав боковогорадикала которого входит дополнительная ε-аминогруппа.
На основании первичнойструктуры пептидов были выдвинуты две вероятные причины увеличениямолекулярной массы метаболитов: в процессе инкубации с микросомальной фракциейпочек и S9 фракцией печени человека происходит реакция дезаминирования по εаминогруппе у С6-атома углерода бокового радикала аминокислотного остатка Lysили реакция дезамидирования по концевой амидогруппе. Первую теорию можетподтверждать тот факт, что метаболиты GHRP-4 и GHRP-5, в состав которых невходит Lys, со сдвигом молекулярной массы на 1 Да детектированы не были. Однакопричиной этого может быть и неспособность использованных метаболических системкатализировать реакцию дезамидирования концевых аминокислот с объемнымииндольным и фенольным кольцами боковых радикалов двух С-концевыхаминокислотных остатков Trp и Phe, соответственно.Дезамидирование доказано на основе фермент-селективной реакции сиспользованием рекомбинантной амидазы.
Анализ полученных реакционных смесейпосле инкубации каждого из изучаемых пептидов с ферментом показал, чтодезамидированные метаболиты GHRP с Lys-концевыми аминокислотными остаткамиобразуются в большем количестве. Таким образом, дезамидированные метаболитыGHRP-4 и GHRP-5, возможно, не были идентифицированы ввиду их небольшогоколичества в реакционных смесях после инкубаций с различными субклеточнымифракциями.12Идентификация in vivo метаболитов GHRP в образцах мочи методом наноВЭЖХМСВРВ исследовании принимали участие пять здоровых волонтеров мужского полаевропеоидной расы, которым назальным способом вводили один из пептидов (GHRP-1,GHRP-2, GHRP-6, гексарелин, ипаморелин).При анализе проб мочи после приема GHRP-2 нами идентифицированы 2метаболита: описанный ранее метаболит GHRP-2 (1-3) ОН и дезамидированныйметаболит GHRP-2 (1-6) ОН.
Метаболит GHRP-2 (1-3) ОН был наиболее долгоживущими интенсивным и является диагностически ценным. В то же время метаболит GHRP2 (1-6) ОН характеризовался низкой интенсивностью сигнала и затруднительнымдетектированием масс-спектрометром низкого разрешения из-за близости значения егоm/z со вторым изотопом двухзарядного иона исходного соединения.При анализе проб мочи после приема GHRP-6 помимо исходного соединенияидентифицированы четыре его метаболита: GHRP-6 (2-6) NH2, GHRP-6 (2-5) ОН иметаболиты GHRP-6 (1-6) ОН, GHRP-6 (2-6) ОН.Последние два метаболитадетектированы в следовых количествах, поэтому в качестве диагностически значимыхметаболитов были выбраны метаболиты GHRP-6 (2-6) NH2 и GHRP-6 (2-5) ОН.Анализ проб мочи после приема гексарелина и ипаморелина показал интенсивныйметаболизм пептидов с образованием дезамидированных метаболитов и метаболитов,образующихся за счет протекания протеолитического гидролиза пептидных связей(гексарелин (2-5) ОН, гексарелин (1-3) ОН, ипаморелин (1-4) ОН, соответственно).Временные окна детектирования метаболитов гексарелин (1-3) ОН и ипаморелин (14) ОН были шире, чем исходных соединений, поэтому данные метаболиты признаныдиагностически значимыми.Особую значимость с точки зрения антидопингового контроля представляютсоединения GHRP-1 и алексаморелин, характеризующиеся быстрой деградацией.Поскольку основным метаболитом алексаморелина является алексаморелин (2-7), чьяструктура аналогична гексарелину, изучать метаболизм данного соединения отдельнонецелесообразно.
При анализе проб мочи волонтера после приема препарата былапоказана полная деградация GHRP-1 с образованием 6 метаболитов: амидированных идезамидированных метаболитов GHRP-1 (2-7) и GHRP-1 (3-7), а также GHRP-1 (36) ОН и GHRP-1 (2-4) ОН.
Метаболит GHRP-1 (2-4) ОН был наиболее долгоживущим идетектировался до 27 ч после приема препарата, поэтому был признан диагностическиценным. Данный метаболит описан впервые, его структура подтверждена методомнаноВЭЖХ-МСВР.Таким образом, после приема пяти GHRP в моче волонтеров идентифицировано17 метаболитов, 8 из которых признаны диагностически значимыми для мониторинга сцелью выявления злоупотребления GHRP методом СВЭЖХ-МС/МС в целяхантидопингового контроля (Таблица 3).Таблица 3 — Элементный состав, точные массы и временное окно детектирования исходных пептидов и метаболитов,идентифицированных методом наноВЭЖХ-МСВР (диагностически значимые метаболиты выделены серым, исходныесоединения обозначены *)СоединениеGHRP-1*GHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (2-7) OHGHRP-1 (2-4) OHGHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1 (3-7) OHGHRP-1 (3-6) OHGHRP-2*GHRP-2 (1-6) OHGHRP-2 (1-3) OHGHRP-6*GHRP-6 (1-6) OHGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-6) OHGHRP-6 (2-5) OHГексарелин*Гексарелин (1-6) OHГексарелин (2-5) OHГексарелин (1-3) OHИпаморелин*Ипаморелин (1-5) OHИпаморелин (1-4) OHАминокислотная последовательностьХимическаяструктураИон-прекурсор,m/zОкна детектированияпосле приема,чAla-His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-OHHis-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-OHAib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2Aib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-OHAib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-OHC51H62N12O7C48H57N11O6C48H56N10O7C30H30N6O4C42H50N8O5C42H49N7O6C36H37N5O5C45H55N9O6C45H54N8O7C19H23N3O4C46H56N12O6C46H55N11O7C40H49N9O5C40H48N8O6C34H36N6O5C47H58N12O6C47H57N11O7C35H38N6O5C21H26N6O4C38H49N9O5C38H48N8O6C32H36N6O5478.25052+442.73192+443.22392+424.1979+374.20252+374.69452+620.2873+409.72102+410.21302+358.1761+437.22962+437.72162+736.3929+737.3770+609.2820+444.23742+444.72942+623.2982+427.2088+356.70012+357.19212+293.14462+не детектирован211027187.5104747472381281227112532292437Способ определения GHRP в моче методом СВЭЖХ–МС/МСРазработанный способ определения GHRP в моче состоит из двух стадий:пробоподготовки методом ТФЭ и инструментального анализа.
При небольшомколичестве проб и при подтверждающих анализах для пробоподготовки образцов мочиТФЭ предлагается использовать картриджи с 30 мг полимерного сорбента скатионобменной и обращенно-фазной функциональностью. При количестве проб >25рассмотрен вариант использования планшетов для микроэкстракции с 2 мг сорбента.Данный подход позволяет значительно сократить время пробоподготовки и расходреагентов. Замена ручного доведения рН образцов мочи разбавлением буфернымраствором с оптимальным значением рН также значительно сокращает длительностьпробоподготовки.При валидации способа определения GHRP и их метаболитов с предложеннымивариантамипробоподготовкиустановленыследующиеметрологическиехарактеристики: селективность/специфичность, линейность, прецизионность в условияходного дня и между днями, предел обнаружения, степень извлечения и влияниекомпонентов матрицы (эффект матрицы) (Таблица 4).Для оценки селективности/специфичности проводили пробоподготовку 10образцов мочи, заведомо не содержащих целевых субстанций, и образца мочи сконцентрацией GHRP и их метаболитов 2 нг/мл.
При отсутствии интерферирующихпиков компонентов матрицы с отношением сигнал/шум более или равным 3:1выбранный ионный переход признавался селективным.Линейность оценивали в диапазоне концентраций 0.5-10 и 2-20 нг/мл при ТФЭ накартриджах и планшетах для микроэкстракции, соответственно.При оценке прецизионности анализировали по 6 образцов мочи с концентрациейGHRP и их метаболитов 2 нг/мл (ТФЭ на картриджах) и 10 нг/мл (ТФЭ на планшетахдля микроэкстракции) в течение одного дня (intra-day) и трех дней (inter-day).Для установления предела обнаружения проводили анализ по 6 образцов мочи сконцентрацией определяемых соединений 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 и 5 нг/мл. Пределомобнаружения принимали минимальную концентрацию, при которой соединениедостоверно идентифицировали во всех пробах с соотношением сигнала к шуму ≥ 3.Определение степени извлечения изучаемых соединений из мочи проводилисравнением результатов, полученных при анализе 6 образцов мочи с добавлениемGHRP и их метаболитов до ТФЭ и перед инструментальным анализом в концентрации2 нг/мл (ТФЭ на картриджах) и 10 нг/мл (ТФЭ на планшетах для микроэкстракции).Для оценки влияния компонентов матрицы (эффекта матрицы) GHRP и ихметаболиты добавляли в воду после ТФЭ в аналогичных концентрациях.Таблица 4 — Основные метрологические характеристики: линейность, прецизионность в условиях одного дня (intraday, n=6) и нескольких дней (inter-day, n=8), предел обнаружения, а также степень извлечения и эффект матрицы1340594113181835559612921305959604258615762546956495856ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %20.10.050.11220.050.050.20.2110.1СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %6/2613/2324/236/116/96/74/826/2128/2626/275/236/1119/2728/270.895ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, нг/мл2123141119151520212021251620ПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
