Автореферат (1091768), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Определение метаболитовin vivo пяти наиболее известных представителей GHRP после назального приемапозволило выявить наиболее интенсивные и долгоживущие метаболиты в моче.Для эффективного анализа проб мочи спортсменов предложено четыре различныхпротокола пробоподготовки. Замена ручного способа подведения рНразбавлением образцов мочи буферным раствором позволяет значительноупростить процесс пробоподготовки, тем самым повысить производительностьспособа. Использование планшетов для микроэкстракции вместо картриджей дляТФЭ сокращает время пробоподготовки и расход реагентов. В ходе апробациипредложенного способа определены окна детектирования пяти GHRP посленазального приема и показано влияние индивидуальных метаболическихособенностей волонтеров и способов приема на метаболизм пептидов при21анализе образцов мочи и сыворотки крови волонтеров после однократноговведения GHRP-2 назально и внутривенно и GHRP-6 назально.Предложенный способ определения метаболитов GHRP в биожидкостяхчеловекадополнилранееразработаннуюметодикуопределениянизкомолекулярных соединений пептидной природы в целях антидопинговогоконтроля.
Опыт успешного в течение 3 лет применения методики позволилспециалистам ФГБУ АДЦ выявить случаи злоупотребления соединениямиданного класса спортсменами.Выводы1. Выделены и идентифицированы 25, 23, 61 и 58 метаболитов для 8соединений класса GHRP в результате инкубации с сывороткой человеческойкрови, микросомальными фракциями печени и почек человека, S9 фракциейчеловеческой печени, соответственно.2. Установлено, что человеческие почечная микросомальная и печеночная S9фракции представляют собой наиболее эффективные in vitro модели для изученияпроцессов биотрансформации соединений пептидной природы в организмечеловека.
Помимо гидролиза пептидных связей основным направлениемметаболизма является замена NH2-группы на ОН-группу при С-концевомаминокислотном остатке при дезамидировании.3. Идентифицированы 17 метаболитов in vivo для 5 наиболее популярныхсоединений класса GHRP, 16 из них – впервые в моче человека.Идентифицирован не описанный ранее метаболит GHRP-1 (2–4) ОН в образцахмочи после однократного назального приема пептида. Данный метаболитхарактеризуется наибольшим временным окном детектирования (до 27 ч) ипризнан наиболее диагностически ценным среди остальных метаболитов GHRP-1.Мониторинг этого и других метаболитов представляет единственный способвыявить факт приема GHRP-1 в виду полной деградации исходного соединения.4.
Диагностически ценными признаны 8 из 17 детектируемых метаболитовin vivo и включены в разработанный способ определения метаболитов GHRP вмоче человека методом СВЭЖХ-МС/МС.5. Разработана методика определения GHRP и их метаболитов в образцахмочи человека методом СВЭЖХ-МС/МС.6. Предложены четыре протокола условий выделения GHRP и их метаболитовиз мочи человека методом ТФЭ, что значительно повысило экспрессность анализаи снизило время пробоподготовки образцов и расход реактивов.227. Предложенная методика качественного определения GHRP и ихметаболитов в моче человека методом СВЭЖХ-МС/МС валидирована всоответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025.8.
При апробации методики оценены временные окна детектирования пятиGHRP и их метаболитов в моче после приема пептидов, показано влияниеиндивидуальных метаболических особенностей волонтеров и способов приема напроцессы биотрансформации соединений, подтверждено преимущество мочиперед сывороткой крови в качестве объекта анализа.9. Применение предложенного способа определения GHRP и их метаболитов вмоче человека позволило специалистам ФГБУ АДЦ выявить случаизлоупотребления соединениями данного класса спортсменами.СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИСтатьи:1.I.O.
Zvereva,E.N. Semenistaya,G.I. Krotov,G.M. Rodchenkov.Comparison of various in vitro model systems of the metabolism of syntheticdoping peptides: proteolytic enzymes, human blood serum, liver and kidneymicrosomes and liver S9 fraction // J. Proteomics. ― 2016. ― Vol. 149. —P. 85—97.2. E. Semenistaya, I. Zvereva, G.
Krotov, G. Rodchenkov. Solid-phaseextraction of small biologically active peptides on cartridges and microelution96-well plates from human urine // Drug Test. Anal. ― 2016. ― Vol. 8 ―No 9. — P. 940—949.3. P. Ferro, G. Krotov, I. Zvereva, G. Rodchenkov, J. Segura. Structure-activityrelationship for peptidic growth hormone secretagogues // Drug Test. Anal. ―— 2017.
— Vol. 9. — No 1. — P. 87—95.4. E. Semenistaya, I. Zvereva, A. Thomas, M. Thevis, G. Krotov,G. Rodchenkov. Determination of growth hormone releasing peptidesmetabolites in human urine after nasal administration of GHRP-1, GHRP-2,GHRP-6, Hexarelin, and Ipamorelin // Drug Test. Anal. ― 2015. ― Vol. 78 ―No 10. — P. 919-25.Тезисы докладов:1. Зверева И.О., Чуловская А.Л., Дудко Г.А., Ефимова Ю.А.,Дикунец М.А. Подходы определения синтетических аналогов рилизинггормона, ютеинизирующего гормона и других биоактивных пептидов вантидопинговом контроле// III Всероссийская конференция23«Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез»,Краснодар, Россия.
2017. Стр. 80.2. Irina Zvereva, Ekaterina Semenistaya, Grigory Krotov, GrigoryRodchenkov. In vitro metabolism of small bioactive peptides in plasma, liverand kidney subcellular fracrions // 14th Human Proteome Organization WorldCongress HUPO-2015. Vancouver, Canada. 2015. P. 184.3. Grigory Krotov, Irina Zvereva, Pedro Ferro, Ekaterina Semenistaia,Alexander Filatov, Jordi Segura and Grigory Rodchenkov. Purification andanalysis of growth hormone secretagogues and its biologically activemetabolites by cell membrane-based receptor binding followed by LC-MS/MS// 33rd Cologne Workshop on Dope Analysis (Manfred Donike Workshop).Cologne, Germany.
2015. P. 259.4. Ferro P., Krotov G., Zvereva I., Rodchenkov G., Segura J. Structureactivity relationsships for growth hormone secretagogues and their potentialinterest for the fight against doping // 33rd Cologne Workshop on DopeAnalysis (Manfred Donike Workshop). Cologne, Germany. 2015. P. 257-259.5. Irina Zvereva, Ekaterina Semenistaya, Grigory Krotov and GrigoryRodchenkov Effectiveness of various in vitro model systems for the predictionof the small biologically active peptide metabolites // 33rd Cologne Workshopon Dope Analysis (Manfred Donike Workshop).
Cologne, Germany. 2015.P. 276.6. Ekaterina Semenistaya, Irina Zvereva, Grigory Krotov and GrigoryRodchenkov. Optimization of sample preparation for analysis of smallbiologically active peptides from human urine // 33rd Cologne Workshop onDope Analysis (Manfred Donike Workshop).
Cologne, Germany. 2015. P. 277.БлагодарностиВыражаю благодарность и признательность Директору ФГБУ АДЦ, к.х.н.М.А. Дикунец за содействие в выполнении работы, ценные замечания, советы икомментарии по содержанию и оформлению работы.Я искренне благодарю старшего научного сотрудника ФГБУ АДЦ, к.х.н.Е.Н.
Обухову за полезные советы и помощь на всех этапах выполнениядиссертации.24.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
