Диссертация (1091769), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Только один из разработанныхGHRP – GHRP-2, Pralmorelin с торговым названием GHRP Kaken 100, KakenPharmaceutical Co, – разрешен к применению в качестве препарата при лечениизаболеваний дефицита ГР в Японии, однако другие аналоги доступны на«черном» рынке [10–12].
Таким образом, изучение метаболизма соединенийданного класса и поиск их метаболитов, полученных с помощью различныхin vivo и in vitro подходов, является актуальной и важной задачей при разработкеметодики для эффективной системы антидопингового контроля с цельювыявления случаев злоупотребления GHRP спортсменами.6Диссертационная работа посвящена оценке эффективности использованияразличных подходов in vitro и in vivo при разработке способа определенияметаболитов GHRP в биожидкостях человека, который дополнил разработаннуюранее методику определения низкомолекулярных соединений пептидной природыметодом СВЭЖХ-МС/МС в целях антидопингового контроля.
В рамкахисследования подобраны оптимальные in vitro модели получения метаболитов,эффективность которых подтверждена изучением метаболитов GHRP in vivoпосле приема волонтерами. При выполнении работы оптимизированы условиячетырех протоколов пробоподготовки образцов мочи и инструментальногоанализа, проведена валидация антидопинговой методики определения GHRP и ихметаболитов в моче человека. Работа позволила повысить эффективностьантидопингового контроля и предотвратить злоупотребление данным видомдопинга спортсменами.Данная работа частично выполнена в ходе государственного контракта№458 от 8 сентября 2014 года на научно-исследовательскую работу дляМинистерства спорта Российской Федерации по лоту №6 по теме «Разработкаантидопинговой методики анализа метаболитов рилизинг пептидов гормона ростав биологических жидкостях человека».Цели и задачи исследованияЦельнастоящейработызаключаетсявоценкеэффективностипрогнозирования образующихся в организме человека метаболитов GHRP сиспользованиемразличныхэффективногоспособаподходовin vitroкачественногоиихприразработкеопределенияметодомin vivoсверхвысокопроизводительной высокоэффективной жидкостной хроматографии всочетаниистандемноймасс-спектрометрией(СВЭЖХ-МС/МС)дляантидопингового контроля.Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:1.ИзучениеметаболитовGHRP,полученныхсиспользованиемразличных моделей in vitro: протеолитические ферменты, человеческая плазмакрови, микросомы почек и печени, S9 фракция печени человека.72.
Идентификация метаболитов GHRP в моче человека, образовавшихсяin vivo после назального приема волонтерами пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP6, гексарелин и ипаморелин.3.Сравнение эффективности изученных моделей in vitro и выявлениеоптимальных для моделирования процессов биотрансформации допинговыхпептидных соединений в организме человека.4.Выбор наиболее интенсивных и долгоживущих диагностическиценных метаболитов GHRP с целью их мониторинга для определения фактовзлоупотребления данным видом допинга.5.Разработка способа хроматомасс-спектрометрического определенияметаболитовGHRPвобразцахсмочичеловека.разработаннойметодикиопределениемхарактеристик:селективность/специфичность,Проведениеследующихпределвалидацииметрологическихобнаружения(ПО),линейность, прецизионность в условиях одного дня и между днями, а такжеоценка степени извлечения анализируемых соединений и влияния матрицы.6.Апробацияразработанногоспособадляопределениявременидетектирования GHRP и их метаболитов после приема и оценки влиянияиндивидуальных особенностей человеческого организма и разных способовприема GHRP на их метаболизм после назального и внутривенного введениянекоторых представителей этого класса.Научная новизна работыВ диссертации представлены результаты исследования метаболизма GHRP сиспользованием различных in vitro моделей, показана эффективность модельныхсистем in vitro микросомальной почечной и S9 печеночной фракций человека.Выявлены закономерности биотрансформации in vivo 5 наиболее широкоизвестных препаратов GHRP в человеческом организме (для 4 из 5 препаратов –впервые).Наосновеполученныхрезультатовразработанхроматомасс-спектрометрический способ определения метаболитов GHRP для выявления ипредотвращения использования данного вида допинга в спорте.
Разработанная8методика позволяет выявлять случаи злоупотребления GHRP, в том числе быстрометаболизирующими представителями данного класса.Впервыедетектировансамыйдолгоживущийизописанныхранееметаболитов GHRP-1 (2-4) ОН, мониторинг которого позволяет выявлять случаизлоупотребления GHRP-1, который не обнаруживается в моче в исходном виде.Проведена оценка влияния физиологических особенностей человеческогоорганизма и способов приема на метаболизм GHRP (на примере приемапрепаратов GHRP-2 и GHRP-6), показана эффективность включения метаболитовв антидопинговую методику.Теоретическая и практическая значимость работыСравнение различных in vitro моделей метаболизма GHRP показало, чтопеченочная S9 и почечная микросомальная фракции человека являются наиболееэффективнымимоделямидлямоделированияпроцессовтрансформациибиоактивных пептидов и прогнозирования образующихся в организме человекаметаболитов.
Детектирование метаболитов после назального введения наиболеепопулярных GHRP (in vivo метод исследования) позволило оценить выбраннуюin vitro модель метаболизма и получить сведения о наиболее интенсивных идолгоживущих диагностически значимых метаболитах.
Полученные данные леглив основу способа определения исходных веществ и метаболитов GHRP вбиологических жидкостях человека. Определение метаболитов GHRP увеличиловременное окно детектирования после приема допинга и достоверностьидентификации, что особенно актуально для GHRP-1 и алексаморелина ввиду ихбыстрой деградации.
Разработанный способ валидирован в соответствии стребованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и внесен в область аккредитации (шифрSOP P1.016)Федерального«Антидопинговыйцентр»государственного(ФГБУАДЦ).Опытбюджетногоуспешногоучрежденияпримененияпредложенного способа определения GHRP и их метаболитов позволилспециалистам ФГБУ АДЦ выявить случаи злоупотребления соединениямиданного класса спортсменами..9Положения, выносимые на защиту1.Выбор оптимальных моделей in vitro для моделирования процессовбиотрансформации допинговых пептидных соединений в организме человека.2.Выявление наиболее диагностически ценных метаболитов GHRP сцелью их мониторинга.3.Способ определения GHRP и их метаболитов, выделенных из мочичеловека, методом СВЭЖХ-МС/МС.4.Исследование влияния индивидуальных особенностей человеческогоорганизма и разных способов приема GHRP на их метаболизм после назального ивнутривенного введения некоторых представителей класса.Степень достоверности и апробация работыОсновные результаты исследования были представлены на международныхконференциях: “33rd Cologne Workshop on Dope Analysis (Manfred DonikeWorkshop)” (Кельн, Германия, 2014), “The 14th HUPO World Congress” (Ванкувер,Канада, 2015) и III Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография икапиллярный электрофорез» (Краснодар, Россия, 2017).
По теме диссертацииопубликовано 10 печатных работ – 4 статьи в реферируемых научных журналах и6 в трудах конференций.Личный вклад автораПостановка цели и задач исследования, обобщение литературных данных,проведениенаучныхэкспериментовиоценкаполученныхрезультатов,подготовка и написание научных статей в соавторстве выполнены лично автором.Структура и объем работыДиссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, спискалитературы и приложения.
Работа изложена на 161 страницах, содержит 24рисунка, 16 таблиц и список цитируемой литературы из 180 источников.10Глава 1. Литературный обзор1.1 Гормон роста и его секретагогиГР, также известный как соматотропный гормон (СТГ), соматотропин,соматропин, представляет собой гормон пептидной природы, секретирующийсясоматотрофнымиклеткамипереднейдолигипофиза.ГенГРчеловекарасполагается в особом кластере на длинном плече 17 хромосомы (17q24.2).Данный кластер включает пять генов: ген ГР GH-N (N-«normal» или GH1 gene),экспрессия с которого происходит в основном в соматотрофных клеткахгипофиза, ген плацентарного гормона роста GH-V (V-«variant» или GH2 gene), двагена плацентарного лактогена (гены CS1 и CS2), кодирующие белковыепродукты, вырабатываемые клетками синцитиотрофобласта плаценты прибеременности с максимальной концентрацией на 37 неделе, и псевдогенплацентарного лактогена или лактоген-близкородственного белка [3,13–15].Главный продукт экспрессии гена GH-N представляет собой белковуюпоследовательность,состоящуюиз191аминокислотныхостатков,смолекулярной массой 22 124 Да и изоэлектрической точкой pI 5.1.
В третичнойструктуре молекулы ГР имеются две внутримолекулярные дисульфидные связи(Cys53―Cys165 и Cys183―Cys189), формирующие большую и малую петли.Подобная структура ГР является высоко консервативной среди млекопитающих.ГР синтезируется в виде предшественника – прогормона, включающего Nконцевую аминокислотную последовательность из 26 аминокислот. В процессе«созревания»происходитотщеплениесигнальнойпоследовательности,врезультате чего «зрелая» молекула ГР становится чрезвычайно нестабильной [3].Также идентифицированы две другие изоформы ГР с массами 20 и 17.5 кДа ,образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК молекулыпредшественника ГР. 20 кДа-изоформа человеческого ГР склонна к димеризациис образованием гомодимеров (20 кДа/20 кДа) и гетеродимеров в комплексе с22 кДа-изоформой ГР (20 кДа/22 кДа).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
