Диссертация (1091769), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Пределы обнаруженияпептидов составили 0.2-1 нг/мл, степень извлечения варьировалась от 47 до 95%.Прецизионность в условиях одного и нескольких дней была менее 20% при48концентрациях 5 и 10 нг/мл (n=6 и n=18). Значительного влияния коэлюируемыхкомпонентов матрицы на ионизацию соединений не выявлено.В качестве альтернативы авторы также предложили определять GHRP вобразцах мочи методом сверхвысокопроизводительной высокоэффективнойнанопотоковойжидкостнойхроматографиивсочетаниисМСВРсиспользованием масс-спектрометра гибридного типа модели Q Exactive фирмыThermo [149].
Разделение соединений осуществляли на аналитической колонкеAcquity nanoUPLC® BEH130 C18 (100 мкм × 100 мм, размер частиц 1.7 мкм) спредварительным концентрированием образцов на специальной предколонкеSymmetry C18 (180 мкм × 20 мм, размер частиц 5 мкм). В качестве подвижных фазиспользовали 0.1% раствор муравьиной кислоты в воде (А) и ацетонитриле (В).Загрузку образца на концентрирующую предколонку проводили в течение 4 минпри скорости потока 8 мкл/мин, хроматографическое разделение осуществляли последующей программе: 0 мин – 1% (В), 20 мин – 35% (В), 22 мин – 80% (В), 30мин – 1% (В).
Скорость потока составляла 500 нл/мин. Масс-спектрометрическоедетектирование пептидов проводили в условиях ЭРИ с нагреваемым потоком.Сбор данных осуществлялся в режимах мониторинга выделенных ионов (SIM Selected-Ion Monitoring) и регистрации ионов-продуктов с интеллектуальнымвыбором ионов-прекурсоров при энергии коллизии 35 эВ и разрешениях 70 000 и17 000 FWHM, соответственно. Регистрируемые ионы-прекурсоры были те же(Таблица 3). В экспериментах для ретроспективного анализа идентификациюсоединений дополнительно проводили в режиме сканирования по полномуионному току с разрешением 70 000 FWHM в диапазоне m/z 350-1200.Разработанная методика определения GHRP в моче методом наноВЭЖХМСВРхарактеризуетсяудовлетворительнойлинейностьювдиапазонеконцентраций 0–0.5 нг/мл с коэффициентами корреляции более r=0.98.
Пределыобнаружениясоставили2-10 пг/мл,степеньизвлечения–45–95%ипрецизионность – 5–16%, соответственно. Значительного влияния компонентовматрицы на ионизацию определяемых соединений не выявлено.49Методика количественного определения GHRP-6 в плазме крови человекаметодом ЖХ-МС при детекции целевых соединений время-пролетным массанализатором описана в работе [150]. Поскольку способ не используется дляидентификации GHRP-6 и его аналогов в допинг-контроле, останавливаться наподробностях в данном обзоре литературных данных не будем.В целях конного допинг-контроля авторами китайской специализированнойлаборатории разработана методика идентификации GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6,гексарелина и ипаморелина в плазме крови лошадей методом СВЭЖХ-МСВР[121].
В качестве внутреннего стандарта использовали тетрапептид Met-Arg-PheAla (MRFA). Для очистки и концентрирования целевых соединений изразбавленных в два раза 1.25% водным раствором аммиака образцов плазмыиспользоваликартриджиOasis®MAX,характеризующиесясмешанныммеханизмом удерживания на основе обращенно-фазовых и анионо-обменныхвзаимодействиях. Хроматографическое разделение компонентов экстрактовосуществляли на аналитической колонке UPLC® BEH300 C18 (50 × 2.1 мм, размерчастиц 1.7 мкм) по следующей программе: 0 мин – 2% (В), 4 мин – 20% (В), 15мин – 98% (В), 17 мин – 98% (В), 18 мин – 2% (В), 20 мин – 2% (В). Водныйраствор 0.1% муравьиной кислоты (А) и метанол (В) применялись в качествеподвижных фаз при скорости потока 0.3 мл/мин, объем наносимого образца –20 мкл.Масс-спектрометрическоедетектированиепептидовпроводилисиспользованием масс-спектрометра высокого разрешения модели Velos фирмыThermo в условиях ЭРИ с нагреваемым потоком.
Сбор данных проводился вдиапазоне масс m/z 100-1000 в режиме сканирования полного ионного тока сразрешением 30 000 FWHM и мониторинга ионов-продуктов с разрешением7 500 FWHM. Регистрируемые ионы-прекурсоры и регистрируемые ионыпродукты приведены в Таблице 4.50Таблица 4 ― Ионы-прекурсоры и ионы-продукты определяемых GHRP,образующиеся при соответствующих энергии коллизии [121]СоединениеИон-прекурсор,m/z319.23+409.72+437.22+444.22+356.72+GHRP-1GHRP-2GHRP-6гексарелинипаморелинИон-продукт,m/z332.15552+550.31363+728.33034+742.34599+490.281272+Энергияколлизии, эВ30При валидации методики показана специфичность выбранных ионныхпереходов, предел обнаружения составил менее 50 пг/мл для всех определяемыхсоединений.
Эффект матрицы и степень извлечения варьируются от 37 до 87% иот –100 до 97%, соответственно, при анализе проб с концентрацией соединений5 нг/мл. Прецизионность оценивали по площади пиков и времени удерживаниясоединений, и которая составила 5.3–15.3% и 0.24–0.35%, соответственно.Помимоопределенияинтактныхпептидовавторыпредлагаюттакжедетектировать 7 метаболитов, синтезированных в условиях in vitro при инкубацииGHRP с S9 фракцией лошадиной печени.Для улучшения чувствительности определения GHRP методом ВЭЖХМС/МСавстралийскаядериватизировать[6].антидопинговаяДляэтогопослелабораторияподкисленияпредложилаобразцовихмочитрихлоруксусной кислотой в соотношении 1/0.1 (об./об.) пептиды сорбировали насмоле картриджей для ТФЭ, а затем дериватизировали уксусным ангидридом посвободным NH2-группам. В виду наличия дополнительной NH2-группы уаминокислотного остатка лизина, за исключением GHRP-4 и GHRP-5, все GHRPвключали по 2 ацетильных группы.
Затем ацетилированные соединенияэлюировалиссорбента,элюатыупаривали.Полученныеэкстрактыперерастворяли и анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС.Хроматографическое разделение компонентов экстрактов осуществляли нааналитической колонке ProteoCol® G203 C18 (150 × 2.1 мм) по следующей51программе: 0 мин – 25% (В), 3 мин – 60% (В), 3.5 мин – 85% (В), 4.3 мин – 85%(В), 4.7 мин – 25% (В), 6.1 мин – 25% (В). Водный раствор 0.1% муравьинойкислоты (А) и ацетонитрил (В) применялись в качестве подвижных фаз прискорости потока 0.3 мл/мин, объем образца – 20 мкл. В качестве альтернативы дляразделения при разработке методики применяли аналитическую колонкуProteoCol® G203 C18 (2.1 × 150 мм). Масс-спектрометрическое детектированиепептидов проводили с использованием масс-спектрометра модели Q-Trap 5500фирмы AB Sciex в режиме положительной ионизации.
Сбор данных проводился врежиме мониторинга селективных реакций (SRM). Поскольку при разработке ивалидации методики анализировали образцы мочи человека и лошадей, ионныепереходы определяемых пептидов приведены в обеих матрицах (Таблица 5). Заисключениемвнутреннегостандарта,идентификациюкаждогоцелевогосоединения проводили по двум и более ионным переходам.Предложенная методика идентификации GHRP в образцах мочи лошадей ичеловека характеризуется линейностью с коэффициентами корреляции r=0.991–0.999 в диапазоне концентраций 5–1000 пг/мл при пределах обнаружениясоединений 5–10 пг/мл в моче человека и 5–25 пг/мл в моче лошадей.
Степеньизвлечения в образцах мочи лошадей и человека варьировались в диапазонах 35–92% и 38–110%, соответственно. Точность измерения в образцах мочи лошадей ичеловека варьировалась от 10 до 53% и от 3 до 8%, соответственно.Прецизионность при анализе проб в течение 6 дней была сопоставима и составилав среднем 24% [6].52Таблица 5 ― Ион-прекурсоры и определяемые ионы-продукты определяемыхсоединенийвмочелошадей(Л) ичеловека(Ч),образующиесяприсоответствующих энергии коллизии [6]СоединениеИон-прекурсор, m/zЛGHRP-1Ч1039.5968.5GHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (3-7) NH2831.4GHRP-2902.5GHRP-4650.3GHRP-5813.4GHRP-6957.5521.8алексаморелин1042.5гексарелин971.51042.5971.5398.7ипаморелин796.4769.4520.353Ион-продукт, m/zЛЧ448.2519.2377.2448.2781.3644.3497.2504.3382.2568.3715.3486.2300.1458.2649.3463.2392.2366.2437.2770.3522.2251.1451.2522.2251.1451.1380.2380.2451.2451.2784.4784.4265.1462.2669.4462.2609.3609.3251.1448.2Энергияколлизии, эВЛЧ625960555060555047373322342926324560574955696255696260605555494952244544404067351.4.2 Метод конкурирующего связывания лигандов с рецептором грелинаВ условиях большого и постоянно растущего числа разнообразныхсекретагогов ГР как пептидной, так и непептидной природы, в 2010 годуиспанскаяантидопинговаялабораторияпредложилаальтернативныйуниверсальный подход выявления употребления стимуляторов выработки ГРдаже неизвестной структуры [8].
Предложенная методика основывается наподходе конкурирующего связывания между природным агонистом грелином сизотопной меткой (125I-грелин) и его синтетическими аналогами с рецепторомгрелина GHS-Ra1, экспрессированным на поверхности клеток линии HEK-293. Напервом этапе пробоподготовки авторы предполагают концентрировать иобессоливать образцы мочи методом ТФЭ с использованием картриджейOasis®HLB.
Полученные экстракты затем инкубируются в присутствии изотопномеченого грелина и мембран с экспрессированным GHS-Ra1, полученных приобработке клеток ультразвуком. Наличие секретагога в пробе определяется повеличине сигнала, измеренного γ-счетчиком в присутствии положительного иотрицательного контролей. В качестве положительного контроля использовалипробу с добавлением 7.5 мМ GHRP-2.
Воспроизводимость данной методикисоставила около 30% [151]. Предел обнаружения GHRP-2 при идентификациипредложенным методом составляет 400 пМ, что соответствует 0.4 нг/мл [152]. В2016годуавторыпредложилииспользоватьдетектированиехемилюминесцентного сигнала, что позволило избежать ограничений, связанныхс использованием радиоизотопов [153]. Однако при использовании меток наоснове эфиров акридина, субстратов щелочной фосфатазы или пероксидазы хренавместо радиоизотопной метки чувствительность данного подхода несколькониже.Данный метод предлагается для качественного определения секретагоговГР. При наличии соответствующих референсных стандартов содержание допингаможно определить количественно [151].
Однако несмотря на потенциальныевозможностиидентифицироватьсоединенияснеизвестнойструктурой,идентификация GHRP в биожидкостях спортсменов в целях антидопингового54контроля происходит с использованием методик на основе хроматомассспектрометрического подхода.***Анализу метаболитов допинговых субстанций уделяется большое вниманиеприразработкеантидопинговыхметодик.Этовниманиеобусловленовозможностью увеличить окно детектирования после приема допинга идостоверность его идентификации, позволяя избежать ложных результатованализа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
