Диссертация (1091769), страница 14
Текст из файла (страница 14)
ЭндопептидазаLys C – высокоспецифичный протеолитический фермент, характеризующийсянебольшой процентной ошибкой неспецифического расщепления пептиднойсвязи. Данная эндопротеаза является одним из наиболее используемыхпротеолитических ферментов для секвенирования пептидов и белков наряду спротеолитическими ферментами трипсин, Arg-C и Glu-C. Для установленияточной пептидной последовательности в области протеолитического расщепленияперспективным подходом является использование двух лизил-эндопептидаз Lys Cи Lys N с образованием четырех вариантных полипептидов [164]. Интерес к этомуферментуврамкахданнойработыобусловленналичиемС-концевогоаминокислотного остатка Lys у большинства GHRP.Ферментыхарактеризуютсяразличнойстепеньюспецифичностикопределенным субстратам.
Специфичность зависит от многих факторов:соотношения субстрат – фермент, рН раствора, температуры, присутствияпримесей, в том числе хелатирующих агентов. Поэтому при прогнозированиивозможных «канонических» метаболитов, образующихся в результате сайтспецифического гидролиза GHRP, также учитывали возможные продукты сайтнеспецифического расщепления. Во избежание ложноположительных результатовпри составлении списка возможных метаболитов GHRP с использованиемразличныхпротеолитическихферментовдетектируемых пептидов выбраны следующие:72критериямисоответствия1)длина гипотетического определяемого метаболита исходного пептидадолжна быть не менее трех аминокислотных остатков;2)один из аминокислотных остатков должен представлять собойискусственную аминокислоту или химическую модификацию, отличающуюметаболит от соединений эндогенного происхождения.Исходные соединения GHRP инкубировали по отдельности с каждым изописанных выше протеолитических ферментов в течение 24 ч при условиях,описанных в разделе 2.4.3.
Полученные образцы разводили в 100 раз ианализировали методом наноВЭЖХ-МСВР. Идентификацию синтезированныхметаболитов проводили по рассчитанной точной массе в режиме селективногомониторингазаданногоионадлякаждогосоединения(tSIM-tMSMS),подтверждение их структуры проводили по a-, b- и y-характеристичным ионам вмасс-спектрах высокого разрешения, полученных в результате фрагментацииионов-прекурсоров в ячейке соударения масс-спектрометра.В зависимости от соотношения количеств протеолитического фермента исубстрата (исходного пептида) в процессе инкубации образовывались различныенаборы метаболитов.
Однако прямой зависимости между соотношениемколичества протеолитического фермента и субстрата, а также специфичностьюпротеолитического фермента и химической структурой исходного соединения невыявлено. Большинство использованных протеолитических ферментовнепродемонстрировали явной специфичности, расщепляя молекулы исходныхсоединенийэндопротеазапонеспецифическимLys Cкатализироваласайтамрасщепления.гидролизПоказано,пептидныхсвязейчтомеждуаминокислотными остатками Ala―His, Ala―(D-β-Nal), Tyr―(D-Trp) и заменуNH2-группынаОН-группуС-концевогоаминокислотногоостаткаLys.Протеолитические ферменты rhCPB, rhCPM и rhAPN продемонстрировалибольшее разнообразие расщепляемых пептидных связей между аминокислотнымиостатками Ala―His, Ala―(D-β-Nal), Tyr―(D-Trp), (D-β-Nal)―Ala, Ala―Trp, (DPhe)―Lys,(D-Trp)―Ala,(D-Mrp)―Ala,His―(D-β-Nal),His―(D-Trp)снекоторыми дополнениями, заключающимися в реакции замещения NH2-группы73на ОН-группу С-концевого аминокислотного остатка Lys в случае пептидаз rhCPBи rhAPN и расщеплении связи His―(D-Mrp) пептидазой rhAPN.
Лейциноваяаминопептидаза, выделенная из свиной почки, катализировала гидролитическоерасщепление пептидных связей между аминокислотными остатками Ala―His,Tyr―(D-Phe), Ala―Trp, в то время как панкреатическая бычья СРВ – Ala―(D-βNal), Tyr―(D-Trp), (D-β-Nal)―Ala, Ala―His, (D-Phe)―Lys, соответственно.Показано, что ферменты катализировали гидролитическое расщепление связи водном соединении, но не катализировали протеолиз по этой же связи в другом.Например, эндопептидаза Lys C осуществляла гидролиз между аминокислотнымиостатками Ala и His в соединениях GHRP-1 и GHRP-2, но не воздействовала нааналогичную связь в алексаморелине. Корреляции составов смесей метаболитов,полученных с использованием ферментов одного класса, но выделенных изразныхисточников,например,рекомбинантнойчеловеческойибычьейпанкреатической карбоксипептидаз В, так же отмечены не были.
Стоит отметить,что рекомбинантные человеческие протеолитические ферменты, полученныегенно-инженерными методами, по сравнению с выделенными из биосырьяферментами, показали большую протеолитическую активность, заключающуюсяв заметном разнообразии полученных метаболитов. На Рисунке 11 схематическиизображены аминокислотные последовательности GHRP с указанием сайтов, покоторымпроисходилогидролитическоерасщеплениеподвоздействиемразличных протеолитических ферментов.
Все детектированные метаболиты,образовавшиеся в серии экспериментов с каждой протеазой, приведены вТаблице 8.74АGHRP-1Lys CrhCPBrhCPMLeu-APrhAPNAla — His ― (D-β-Nal) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2Lys CCPBrhCPBrhCPMrhAPNCPBrhCPBrhCPMrhAPN Lys CrhCPBrhCPMrhAPN(D-Trp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe)GHRP-4NH2Lys CCPBrhCPBrhCPMLeu-APrhAPNrhCPBrhCPMrhAPNrhCPBrhAPNrhCPBrhCPMrhAPNrhAPNrhCPBrhCPMrhAPN rhAPNCPB Lys CrhCPM rhCPBrhAPN rhAPNrhCPBrhCPM rhCPBrhAPN rhAPNLys CrhCPBrhAPNrhCPMLeu-APrhAPNTyr ― (D-Trp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe)GHRP-5NH2Lys CrhAPNHis ― (D-Trp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2GHRP-6CPBrhCPBrhCPMLeu-APrhAPNAla — His ― (D-Mrp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2rhCPBrhAPNHis ― (D-Mrp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2ГексарелинИпаморелинГексарелинCPBrhCPB rhCPBrhCPM rhCPMrhAPN rhAPN(D-Ala) ― (D-β-Nal) ― Ala ― Trp ― (D-Phe) — Lys — NH2GHRP-2АлексаморелинLys CrhCPBrhAPNrhCPMrhAPNLys CCPBrhCPBrhCPM rhCPBLeu-AP rhCPMrhAPN rhAPNrhAPN Lys CAib — HisHis ―― (D-β-Nal)(D-Phe) —— Lys(D-Mrp) ― Ala ― Trp ― (D-Phe)Lys —— NHNH22БLys CCPBCPMLeu-APAPNEC 3.4.21.50EC 3.4.17.2EC 3.4.17.12EC 3.4.11.2EC 3.4.11.2- X-X-K-│-X- X-X-X-│-K- X-X-X-│-R- X-X-X-│-K- X-X-X-│-RA-│-X-X-XA- P-│-X-XA-│-X-X-XA- P-│-X-XРисунок 11 — Схематичное изображение аминокислотных последовательностейGHRP с указанием сайтов расщепления протеолитическими ферментами (А) испецифические сайты расщепления использованных протеаз, согласнолитературным данным (Б) [156]75Таблица 8 — Элементный состав, точные массы ионов-прекурсуров исходных пептидов и метаболитов,синтезированных в условиях in vitro в присутствии протеолитических ферментов: эндопептидазы Lys C, бычьейпанкреатической карбоксипептидазы В (CPB), человеческой рекомбинантной карбоксипептидазы В (rh CPB),человеческой рекомбинантной карбоксипептидазы М (rh CPM), лейциновой аминопептидазы (Leu-AP), человеческойрекомбинантной аминопептидазы N (hr APN)76Leu-APhr APN478.25052+478.74252+442.73192+443.22392+374.20252+479.2765+409.72102+410.21302+747.3977+748.3817+691.3239+550.3136+479.2765+608.2980+422.2190+771.3613+608.2980+422.2190+439.1976+437.22962+rh CPMC51H62N12O7C51H61N11O8C48H57N11O6C48H56N10O7C42H50N8O5C26H35N5O4C45H55N9O6C45H54N8O7C42H50N8O5C42H49N7O6C39H42N6O6C29H40N7O4C26H35N5O4C34H37N7O4C23H27N5O3C43H46N8O6C34H37N7O4C23H27N5O3C23H26N4O5C46H56N12O6Протеолитический ферментrh CPBAla-His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHAla-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-NH2Tyr-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-NH2Tyr-(D-Trp)-Ala-OHHis-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2БруттоформулаИонпрекурсор,m/zCPBGHRP-1GHRP-1 (1-7) OHGHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (2-7) OHGHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1 (5-7) NH2GHRP-2GHRP-2 (1-6) OHGHRP-2 (2-6) NH2GHRP-2 (2-6) OHGHRP-2 (1-5) OHGHRP-2 (3-6) NH2GHRP-2 (4-6) NH2GHRP-4GHRP-4 (2-4) NH2GHRP-5GHRP-5 (2-5) NH2GHRP-5 (3-5) NH2GHRP-5 (1-3) OHGHRP-6Аминокислотная последовательностьLys CСоединение++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++Продолжение Таблицы 877rh CPMrh CPB437.72162+736.3929+609.2820+413.1932+479.2765+444.23742+444.72942+375.70792+550.3136+551.2976+479.2765+479.7571+480.2501+444.23932+444.73122+380.68162+550.3136+479.2753+356.70012+357.19212+314.17372+314.66572+293.14462+245.64432+CPBC46H55N11O7C40H49N9O5C34H36N6O5C20H24N6O4C26H35N5O4C47H58N12O6C47H57N11O7C41H51N9O5C29H40N7O4C29H39N6O5C26H35N5O4C50H63N13O7C50H63N12O8C47H58N12O6C47H57N11O7C41H45N9O6C29H40N7O4C26H35N5O4C38H49N9O5C38H48N8O6C34H42N8O4C34H41N7O5C32H36N6O5C28H35N5O3Протеолитический ферментhr APNHis-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Trp)-Ala-OHTrp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHTrp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHAla-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Aib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2Aib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-OHAib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-OH(D-Phe)-(D-Phe)-Lys-NH2БруттоформулаИонпрекурсор,m/zLeu-APGHRP-6 (1-6) OHGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-5) OHGHRP-6 (1-3) OHGHRP-6 (4-6) NH2ГексарелинГексарелин (1-6) OHГексарелин (2-6) NH2Гексарелин (3-6) NH2Гексарелин (3-6) OHГексарелин (4-6) NH2АлексаморелинАлексаморелин (1-7) OHАлексаморелин (2-7) NH2Алексаморелин (2-7) OHАлексаморелин (2-6) OHАлексаморелин (4-7) NH2Алексаморелин (5-7) NH2ИпаморелинИпаморелин (1-5) OHИпаморелин (2-5) NH2Ипаморелин (2-5) OHИпаморелин (1-4) OHИпаморелин (3-5) NH2Аминокислотная последовательностьLys CСоединение+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++3.1.2 Сыворотка человеческой кровиБелки и пептиды характеризуются низкой мембранной проницаемостьюввиду их гидрофильных свойств и быстрой деградацией в организме, чтосокращает их терапевтический потенциал и значительно сужает спектрвозможных способов приема.
Биодоступность пептидных препаратов при самомудобномпероральномспособеприемаоченьнизкая[36,41],поэтомувнутривенное введение – один из потенциальных способов приема GHRP.Плазма является жидкой составляющей крови организма и содержитбольшое количество различных ферментов, участвующих в биотрансформациипептидных соединений. Альтернативным вариантом изучения метаболизмасоединений, запрещенных к применению в спорте, является инкубация всыворотке и/или плазме крови человека или подопытного животного.Метаболизм соединений класса GHRP был изучен в сыворотке и плазмекрови человека [116,117] и лошадей [6,121]. В работе [116] представлены данныепо метаболизму восьми GHRP в сыворотке человеческой крови, однако из работыне очевидно, в каком из экспериментов идентифицированы те или иныеметаболиты,поскольку вэкспериментовизученияисследованииметаболизматакжеGHRPпредставленывусловияхрезультатыin vivoпослевнутривенной инъекции пептидов крысам.
В статье [117] описаны 10 метаболитовGHRP-2, GHRP-6 и гексарелина, полученные при их инкубации с человеческойсывороткой крови. Согласно данным [6], при инкубации с лошадиной сывороткойкрови большинство GHRP идентифицируются в неизменном виде, в то время какалексаморелин и GHRP-1 претерпевают протеолитическое расщепление свысвобождениемN-концевогоаминокислотногоостатка.Значительнаядеградация GHRP-1 при инкубации с лошадиной плазмой крови также отмечаетсяв работе [121] при изучении устойчивости некоторых соединений GHRP. Авторыпредполагают, что метаболит GHRP-1 (2-7) NH2 образуется в результатеферментативногогидролизаGHRP-1сучастиемэкзопептидазилидипептилпептидазы V лошадиной плазмы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
