Диссертация (1091769), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Временноеокно детектирования метаболитов гексарелин (1-3) ОН и ипаморелин (1-4) ОНбыло шире, чем окно детектирования исходных соединений, поэтому данныеметаболиты также признаны диагностически значимыми.С точки зрения антидопингового контроля особый интерес представляютгептапептидныесоединенияиGHRP-1алексаморелин,нетакиераспространенные на черном рынке, как предыдущие пептиды, но крайнеметаболически нестабильные, согласно литературным источникам [6,116].Поскольку образующийся при отщеплении N-концевой аминокислоты метаболиталексаморелин (2-7) по структуре представляет собой гексарелин, изучатьметаболизм алексаморелина отдельно нецелесообразно.При анализе проб мочи волонтера после приема препарата показана полнаядеградацияGHRP-1собразованием6метаболитов:амидированныеидеамидированные метаболиты GHRP-1 (2-7) и GHRP-1 (3-7) , а также GHRP-1 (36) ОН и GHRP-1 (2-4) ОН.
Метаболит GHRP-1 (2-4) ОН описан впервые, былнаиболее долгоживущим и детектировался до 27 ч после приема препарата.Деамидированные метаболиты GHRP-1 (2-7) ОН, GHRP-1 (3-7) ОН и GHRP-1 (36) ОН детектированы методом наноВЭЖХ-МСВР в следовых количествах,поэтому в дальнейших исследованиях не рассматривались.ЗаисключениемGHRP-1 (2-4) ОН,химическиеструктурывсехдиагностически значимых метаболитов GHRP подтверждены методом встречного98синтеза. Химическая структура GHRP-1 (2-4) ОН подтверждена методом МСВР(Рисунок 17).HNa1110.0715Ny2Относительная интенсивность, %H2N a1CH3ONHbO1a2OHNHa2 b2O+[M+H]307.1551b2424.1973335.1498y2287.1389ион иммония [D-β-Nal]170.0964b1138.0663m/zРисунок 17 — Масс-спектр однозарядного иона-прекурсора метаболита GHRP1 (2-4) ОН, полученный методом наноВЭЖХ-МСВР в режиме tSIM-tMSMS срегистрацией положительных ионовТаким образом, после разового приема 5 соединений, относящихся к классуGHRP, в моче волонтеров идентифицировано 17 метаболитов, 8 из которыхпризнаны диагностически значимыми и включены в методику определенияметаболитов GHRP.
Данный способ дополнил разработанную ранее методикуопределения GHRP методом СВЭЖХ-МС/МС (Таблица 11).99Таблица 11 — Элементный состав, точные массы и временное окно детектирования исходных пептидов и метаболитов,идентифицированных методом наноВЭЖХ-МСВР.
Диагностически значимые метаболиты выделены зеленым(* обозначены исходные соединения)СоединениеGHRP-1*GHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (2-7) OHGHRP-1 (2-4) OHGHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1 (3-7) OHGHRP-1 (3-6) OHGHRP-2*GHRP-2 (1-6) OHGHRP-2 (1-3) OHGHRP-6*GHRP-6 (1-6) OHGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-6) OHGHRP-6 (2-5) OHгексарелин*Гексарелин (1-6) OHГексарелин (2-5) OHГексарелин (1-3) OHИпаморелин*Ипаморелин (1-5) OHИпаморелин (1-4) OHАминокислотная последовательностьБрутто-формулаИон-прекурсор,m/zВремя детектированияпосле приема, чAla-His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-OHHis-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-OHAib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2Aib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-OHAib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-OHC51H62N12O7C48H57N11O6C48H56N10O7C30H30N6O4C42H50N8O5C42H49N7O6C36H37N5O5C45H55N9O6C45H54N8O7C19H23N3O4C46H56N12O6C46H55N11O7C40H49N9O5C40H48N8O6C34H36N6O5C47H58N12O6C47H57N11O7C35H38N6O5C21H26N6O4C38H49N9O5C38H48N8O6C32H36N6O5478.25052+442.73192+443.22392+424.1979+374.20252+374.69452+620.2873+409.72102+410.21302+358.1761+437.22962+437.72162+736.3929+737.3770+609.2820+444.23742+444.72942+623.2982+427.2088+356.70012+357.19212+293.14462+не детектирован211027187.51047474723812812271125322924373.2 Разработка и валидация методики определения GHRP и ихметаболитов в пробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МСНаиболееметаболитыинтенсивныеGHRP-1,иGHRP-2,долгоживущиедиагностическигексарелинаGHRP-6,иценныеипаморелина,идентифицированные в образцах мочи волонтеров после назального приема,дополнили ранее разработанную методику определения низкомолекулярныхсоединенийпептиднойприродыметодомСВЭЖХ-МС/МСвцеляхантидопингового контроля.
Стоит отметить, что все детектированные в моче, ноне включенные в методику метаболиты, могут быть также использованы вкачестве дополнительных доказательств злоупотребления GHRP при проведенииподтверждающих анализов. В процессе разработки методики определения GHRPи их метаболитов оптимизировали условия пробоподготовки образцов мочи иСВЭЖХ-МС/МС анализа.3.2.1 Выбор сорбента для ТФЭОдним из наиболее часто применяемых способов для выделения пептидовиз различных биологических матриц является ТФЭ. Данный подход позволяетдостичь низких пределов обнаружения, обеспечивает избирательное извлечениецелевых пептидов (при оптимальных условиях ТФЭ) и уменьшение влияниякомпонентов матрицы,а также характеризуется простотой и дешевизной.
Внастоящее время на рынке представлен больший выбор сорбентов для выделенияпептидовсразличнымифизико-химическимисвойствами.Исходяизособенностей структуры GHRP, при выборе оптимального сорбента сравнивалиполимерные сорбенты Oasis®HLB, имеющий гидрофильные и липофильныефункциональныегруппы,иOasis®WCX,характеризующийсясмешанныммеханизмом удерживания на основе обращенно-фазовых и ионно-обменныхвзаимодействиях. Выбор слабого катионно-обменного механизма абсорбцииобусловлен наличием положительно заряженных аминогрупп на N- и С-концах, атакже боковом радикале аминокислотного остатка лизина у большинства GHRP иих метаболитов.Пробоподготовкуобразцовмочисконцентрациейанализируемыхсоединений 2, 5, 10 и 100 нг/мл на картриджах Oasis®WCX и Oasis®HLBпроводили в соответствии с п. 2.4.4.1 и 2.4.4.3, соответственно.
Эффективностьметода пробоподготовки оценивали по величине площадей и соотношениюсигнала к шуму идентифицируемых соединений.Согласнополученнымрезультатам,извлечениесиспользованиемкартриджей с обращенно-фазовым и слабым катионно-обменным сорбентамисопоставимы при концентрациях 2 и 5 нг/мл (Рисунок 18). При анализе проб мочис большими концентрациями соединений воспроизводимость результатов быланизкой и характеризовалась большой погрешностью. Показано, что соотношениесигнал/шум пиков определяемых веществ при хроматографическом разделениипосле пробоподготовки с использованием картриджей Oasis®WCX выше.
Этоможно объяснить более избирательным связываниемнизкомолекулярныхсоединений пептидной природы и наличием дополнительной стадии промываниясорбента от неспецифических взаимодействий метанолом, что значительноснижает количество коэлюируемых соединений.Таким образом, на основании экспериментальных данных для выделения иконцентрирования GHRP и их метаболитов из образцов мочи человека выбраныкартриджи Oasis®WCX.Оптимизациюпараметровхроматомасс-спектрометрическогоанализапроводили в автоматическом режиме прямым вводом растворов с концентрациейсоединений 1 мкг/мл во внешний источник ионизации со скоростью 5 мкл/мин.Подбор условий позволил выбрать оптимальные значения радиочастотногонапряжения, подаваемого на S-образную линзу, и энергии соударения в ячейкестолкновений, которые являются важными параметрами, влияющими наинтенсивностьобразующихсяионов-прекурсоровиионов-продуктов,соответственно. Для GHRP-1 (2-4) OH данные значения подбирали в ручномрежиме по графикам зависимости, полученным при серии анализов образца мочипосле приема GHRP-1.
Параметры инструментального анализа представлены вТаблице 12.1021402 нг/млOasis HLBOasis WCX5 нг/млOasis HLB10 нг/млOasis HLBOasis WCX120100806040200Oasis WCX150Относительные значения, %100500140120100806040200140Oasis HLBOasis WCX100 нг/мл12010080604020ипаморелин (1-4) ОНипаморелингексарелин (1-3) ОНгексарелинGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-5) OHGHRP-6GHRP-5GHRP-4GHRP-2 (1-3) OHGHRP-2GHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1алексаморелин0Рисунок 18 — Диаграммы площадей пиков GHRP и их метаболитов(относит. значения, %) при использование картриджей Oasis®HLB и Oasis®WCX103Таблица12—ПараметрыСВЭЖХ-МС/МСанализа(* обозначеныхарактеристичные переходы, используемые при подтверждающих анализах)СоединениеВремяудерживания,минGHRP-12.84GHRP-23.12GHRP-43.26GHRP-53.52GHRP-62.55Алексаморелин2.64Гексарелин2.60Ипаморелин2.22GHRP-1 (2-7) NH22.77GHRP-1 (3-7) NH23.20GHRP-1 (2-4) ОН2.16GHRP-2 (1-3) ОН2.53Ионпрекурсор, продукт,m/zm/z129.1209.2478.42+479.3*747.4*241.22+410.0550.4170.15*269.2*334.3608.4+444.25159.1*258.2*421.3+771.5350.2159.2*129.2324.2437.42+296.2*581.3*129.2409.3480.32+209.5*750.2*129.1338.3444.42+479.3*742.2223.4420.2356.92+129.3*335.1*170.2442.72+335.2170.2479.2374.22+241.2*293.2*287.2424.2+335.1170.2241.2358.3+269.2*287.3*104Энергияколлизии,эВ23201513151224132218332627354334232416251824152016151617172020162525151518201723181014Напряжение,подаваемое наS-линзу, В816510113780086766770659066Продолжение Таблицы 12СоединениеВремяудерживания,минGHRP-6 (2-6) NH22.82GHRP-6 (2-5) ОН3.42Гексарелин (1-3) ОН1.83Ипаморелин (1-4) ОН3.22[13С3;15N1]-GHRP-2[13С3;15N1]-GHRP-2 (13) ОН3.122.31Ионпрекурсор, продукт,m/zm/z159.2479.2368.72+129.2*258.1*335.2441.1609.4+159.1*352.2*310.2338.4427.4+290.2*273.2*223.2820.3293.32+166.1*195.2*412.22+554.2361.2+170.2Энергияколлизии,эВ2211241525173618232128212520162212Напряжение,подаваемое наS-линзу, В1274611039067673.2.2 Выбор способа доведения рНПри разработке методики определения GHRP и их метаболитов методомСВЭЖХ-МС/МС пробоподготовку проб мочи проводили в соответствии сп.2.4.4.1.
Предел обнаружения для GHRP и некоторых метаболитов приконцентрировании соединений в 20 раз составил 0.05–0.2 нг/мл, что значительнониже минимально требуемой определяемой концентрации для данного классасоединений, установленной ВАДА и равной 2 нг/мл [176]. Для эффективностивремя-/трудо- затрат и расхода реагентов разработали альтернативные протоколыпробоподготовки проб мочи с доведением рН путем разбавления буфернымраствором с оптимальным значением рН и использованием планшетов длямикроэктсракции вместо картриджей. Упрощение и снижение стоимостипробоподготовки стало особенно актуальным с введением в 2015 годуТехнического документа ВАДА с указанием минимального необходимогоколичества анализируемых проб для каждой из спортивных дисциплин [177].
Вчастности, 30% от общего количества проб мочи спортсменов-пауэрлифтеров,105тяжелоатлетов и бодибилдеров должны тестироваться на присутствие GHRP и ихметаболитов.Для доведения рН образцов мочи до значения 6.5 в качестве буферногораствора при разбавлении проб мочи выбран фосфатно-солевой раствор,характеризующийся буферной емкостью в диапазоне рН 4.8–8.0. При выбореоптимального соотношения объемов образца мочи и буферного растворапоказано, что наибольшее извлечение достигается при разбавлении 1:1(Рисунок 19).Абсолютная интенсивность60000400002000000.5 мл мочи/0.5 мл буф.р-ра0.5 мл мочи/0.1 мл буф.р-раGHRP-1GHRP-2GHRP-4GHRP-5GHRP-6ГексарелинИпаморелинGHRP-1 (3-7) OHGHRP-2 (1-3) ОНGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-5) OHГексарелин (1-3) ОНИпаморелин (1-4) ОНРисунок 19 — Диаграммы площадей пиков GHRP и их метаболитов при подбореоптимального соотношения моча/буферный раствор106ДанныйопределяемыхспособтакжесоединенийиспользоваликлассаGHRPприспроведениипомощьювыделенияпланшетовдлямикроэкстракции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
