Диссертация (1091769), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Увеличение времени детектирования по сравнениюданными статьи [147] может объясняться различными способами приема,расовыми особенностями волонтеров монголоидной и европеоидных рас,чувствительностью используемого оборудования.Сравнение полученных в данном исследовании результатов in vitro приинкубации с различными модельными системами и in vivo после назальногоприема волонтерами позволило оценить эффективность выбранных модельныхсистем. Показано, что некоторые in vivo метаболиты не были детектированыпосле инкубации с почечной микросомальной и печеночной S9 фракциямичеловека.
Среди таких метаболитов GHRP-1 (3-6) ОН и гексарелин (2-5) ОН.Таким образом, подход in vitro не является универсальным для прогнозированияметаболитов пептидных соединений и не может заменить методы in vivo во всех114ситуациях, но в то же время он предлагает возможности для учета различныхфизиологических особенностей и способов приема препаратов [124].Включениеметаболитов,идентифицированныхприинкубациисразличными модельными системами in vitro, а затем подтвержденных in vivoпосле назального приема волонтерами мужского пола, позволило увеличитьчувствительность и специфичность разработанной и введенной в областьаккредитации ФГУП АДЦ перед Олимпийскими и Паралимпийскими Играми вг. Сочи в 2014 году методики определения запрещенных соединений пептиднойприроды в моче человека.
При рутинном анализе проб спортсменов сиспользованием разработанного способа выявлены случаи злоупотребленияGHRP-6, гексарелина и ипаморелина. Образцы мочи атлетов с неблагоприятныманалитическим результатом анализа на GHRP-6 и гексарелин помимо исходныхпептидовсодержалиметаболитыGHRP-6 (2-6) NH2,GHRP-6 (2-5) ОНигексарелин (1-3) ОН, соответственно, предсказанные ранее с применениемподходов in vitro и in vivo. Метаболитов ипаморелина в образце мочидетектировано не было.Таким образом, упомянутые выше различия времени детектированияGHRP-2 и его метаболита после приема данного препарата волонтерамимонголоидной и европеоидных рас, а также выявление случая злоупотребленияипаморелина без детектирования его метаболитов в пробе мочи спортсменауказывают на вариации, которые могут быть обусловлены рядом факторов ипроверить которые можно, например, экспериментом с бо́льшим количествомучаствующих волонтеров.3.3.2 Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформациюсоединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назальногоприема GHRP-6В данном разделе представлены результаты эксперимента in vivo с бо́льшимколичеством участников, в котором волонтерам мужского пола вводили пептидыGHRP-2 (назально и внутривенно) и GHRP-6 (назально) (Таблица 14).115Таблица 14 — Количество участников, способ приема и доза пептидов GHRP-2 иGHRP-6Способ введенияВнутривенно (i.v.)НазальноДетали экспериментаСоединениеПрием (100 мкг)Контрольная группаПрием (500 мкг)Контрольная группаКоличество волонтеровGHRP-2GHRP-68―2222Представленное исследование является частью совместной работы сиспанскойантидопинговойлабораториейBarcelonaAntidopingLaboratoryинститута Fundació Institut Mar D'Investigacions Mèdiques (IMIM), г.
Барселона.Образцы сыворотки крови и мочи после разового внутривенного введенияпралморелина гидрохлорида (GHRP-2) здоровым добровольцам предоставленыиспанской лабораторией.На первом этапе были опробованы два варианта пробоподготовки образцовсыворотки крови, описанных ранее в литературе: очистка методом ТФЭ ипреципитация мажорных белков ацетонитрилом [116,117]. Показано, чтоизвлечение соединений с использованием ТФЭ примерно в 2 раза ниже посравнению с осаждением белков органическим растворителем (данные неприведены),поэтомувдальнейшемиспользовалсявторойспособпробоподготовки.Анализ образцов мочи и сыворотки крови проводили методом СВЭЖХМС/МС, описанным в разделе 2.4.2.
Расчет концентраций GHRP-2 и GHRP-6, атакже их метаболитов в образцах мочи проводили по калибровочным прямым,концентрации растворов калибровочной прямой составляли 0.5, 1.0, 2.0 и 2.5нг/мл. На Рисунке 22 представлены профили изменения концентраций GHRP-2 иего метаболита GHRP-2 (1-3) OH в образцах сыворотки крови и мочи послеприема GHRP-2 волонтерами мужского пола (средние значения, n=8). ВТаблице 15 приведены средние значения концентраций GHRP-2 и его метаболитас указанием минимальных и максимальных значений в образцах мочи после116приема 100 мкг пралморелина дигидрохлорида здоровыми волонтерами мужскогопола.metGHRP-2 (1-3) OH4Концентрация GHRP-2, нг/мл0,030GHRP-20,0253,530,0202,50,01521,50,01010,0050,500,0000Б612Время, чКонцентрация GHRP-2, нг/мл2518Концентрация GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл4,524GHRP-25GHRP-2GHRP-2 (1-3)(1-3) метOH4,52043,51532,51021,551Концентрация GHRP-2 (1-3) OHА0,5000612Время, ч1824Рисунок 22 — Профили изменения концентраций GHRP-2 и его метаболитаGHRP-2 (1-3) OH в образцах сыворотки крови (А) и мочи (Б) после внутривенноговведения 100 мкг пралморелина дигидрохлорида волонтерам мужского пола(средние значения, n=8)117Таблица 15 — Средние значения концентраций (Mean) GHRP-2 и его метаболита GHRP-2 (1-3) ОН с указаниемминимальных и максимальных значений (Min-Max) в образцах мочи после приема 100 мкг пралморелина дигидрохлоридаздоровыми волонтерамиGHRP-2GHRP-2 (1-3) ОНMean (n=8)(Min-Max)часыMean (n=8)(Min-Max)часы000021.90(1.4–34.4)0–10.32(0–1.54)0–15.85(1.2–15.4)1–20.94(0.03–2.1)1–21.04(0.2–2.8)2–41.98(0.2–4.8)2–40.32(0.2–0.6)4–64.13(0.43–14.9)4–60.11(0.01–0.2)6–120.58(0.16–1.2)6–120.05(0–0.18)12–240.22(0–0.45)12–24Полученные профили изменения концентраций GHRP-2 и его метаболитааналогичны с предоставленными ранее [147,175].
Возможным объяснением болеевысоких пиковых концентраций целевого соединения и его метаболита в данныхработах могут являться особенности монголоидной и европеоидной расы.Стоит отметить, что только в двух из восьми серий проб сыворотки кровиволонтеровпослеоднократноговнутривенноговведенияпралморелинадигидрохлорида был выявлен метаболит основного действующего веществаGHRP-2 (1-3) ОН, в то время как при анализе проб мочи его детектировали впробахвсехволонтеров.Данныйфактможетсвидетельствоватьопревалирующем орган-специфичном метаболизме соединения вне кровеносногорусла.Результаты анализа проб мочи и сыворотки после назального приема500 мкг GHRP-2 и GHRP-6 также могут служить подтверждением предположенияо роли орган-специфичного метаболизма.
В частности, метаболит GHRP-2 (13) ОН идентифицировали в образцах сыворотки крови одного из двух волонтеровпосле приема GHRP-2, в то время как метаболиты GHRP-6 (2-5) ОН и GHRP-6 (26) NH2 в пробах сыворотки крови после введения GHRP-6 выявлены не были.Детектирование метаболита GHRP-2 (1-3) ОН не во всех сериях проб сывороткикрови после приема исходного соединения может указывать на метаболическиеособенностиволонтеров.Обэтомтакжесвидетельствуютразличныеконцентрации детектированных исходных соединений и их продуктов деградациив образцах мочи и сыворотки крови (Таблица 16) и различия профилей измененияконцентраций соединений (Рисунки 23–24).Таблица 16 — Средние значения концентраций (Mean) GHRP-2 и его метаболита GHRP-2 (1-3) и GHRP-6 с указаниемминимальных и максимальных значений (Min-Max) в сыворотке крови после приема 100 мкг пралморелинадигидрохлорида здоровыми испанскими волонтерами и после приема 500 мкг GHRP-2 и GHRP-6 здоровыми российскимиволонтерамиДанные анализа образцов сыворотки крови после внутривенного приема 100 мкг пралморелина дигидрохлорида (GHRP-2)Mean (n=8/8)4.011.530.810.560.390.260.050(Min-Max)(2.3–5.3)(1.1–2.5)(0.6–1.2)(0.2–0.7)(0.2–0.6)(0–0.7)(0–.6)GHRP-2часы00.511.52348Mean (n=1/8)000000.0160.0240(Min-Max)GHRP-2 (1-3) OНчасы00.511.52348Данные анализа образцов сыворотки крови после назального приема 500 мкг GHRP-2 и GHRP-6Mean (n=2/2)0.990.560.270.130.030––(min-Max)(1.34–0.65) (0.8–0.3)(0.3–0.24)(0.16–0.1) (0.01–0.04)GHRP-2часы00.51–2–48Mean (n=1/2)000–0.35–0.180(Min-Max)GHRP-2 (1-3) OНчасы00.51–2–48Mean (n=2/2)1.520.780.270.13GHRP-60––0(Min-Max)(0.9–2.2)(0.6–0.3)(0.4–0.3)(0.2–0.17)часы00.51–2–48024024024024024Волонтер 1Волонтер 1БGHRP-2GHRP-2 (1-3) OH1630122081040612Время, ч1854321000GHRP-26[C]GHRP-2, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл40[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/млА0246Волонтер 23012208104012Время, ч18543210602406301252081040[C]GHRP-2, нг/мл61218432024062081040012Время, ч241824GHRP-26[C]GHRP-2, нг/мл[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл12618Волонтер 416GHRP-2GHRP-2 (1-3) OH012Время, чВолонтер 43024GHRP-2Время, ч401810612Время, чВолонтер 316GHRP-2GHRP-2 (1-3) OH[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/млВолонтер 340024GHRP-26[C]GHRP-2, нг/млGHRP-2GHRP-2 (1-3) ОНmet018Волонтер 216[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл4012Время, ч5432100612Время, ч1824Рисунок 23 — Профили изменения концентраций GHRP-2 и его метаболитаGHRP-2 (1-3) ОН в образцах мочи (А) и сыворотки крови (Б) после внутривенноговведения 100 мкг пралморелина дигидрохлорида (GHRP-2)БВолонтер 516GHRP-2GHRP-2 (1-3) ОН30122081040[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл612Время, ч18GHRP-265432100Волонтер 502406Волонтер 630122081040512Время, ч18432106024061220810401218GHRP-2543202406Время, ч122081040012186[C]GHRP-2, нг/мл[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл163061824Волонтер 8GHRP-2GHRP-2 (1-3) ОН012Время, чВолонтер 84024106186[C]GHRP-2, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл1630012Время, чВолонтер 7GHRP-2GHRP-2 (1-3) ОН[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/млВолонтер 74024GHRP-26[C]GHRP-2, нг/млGHRP-2GHRP-2 (1-3) ОН018Волонтер 616[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл4012Время, ч0,04GHRP-2GHRP-2 (1-3) ОН5[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл40[C]GHRP-2, нг/млА0,03430,0220,01102400Время, чПродолжение Рисунка 23122612Время, ч1824БАВолонтер IIIВолонтер I3GHRP-25GHRP-6[C]GHRP-6, нг/мл[C]GHRP-2, нг/мл624312100061218240612Время, чВремя, ч40,03[C]GHRP-2, нг/мл30,0220,011012Время, ч18GHRP-6210063[C]GHRP-6, нг/мл5GHRP-2GHRP-2 (1-3) ОНmet 0,04[C]GHRP-2 (1-3) OH, нг/мл0,05024Волонтер IVВолонтер II618024612Время, ч1824Рисунок 24 — Профили изменения концентраций GHRP-2, его метаболита GHRP2 (1-3) ОН и GHRP-6 в образцах сыворотки крови после назального приема500 мкг GHRP-2 (А) и GHRP-6 (Б)Анализ образцов мочи показал, что время детектирования GHRP-2 и егометаболита шире, чем в сыворотке крови, и составляет около 6 и 2 ч,соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
