Диссертация (1091769), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Субклеточные фракции приобретены у фирм-производителей,которые для изучения фармакокинетических процессов представляют широкоеразнообразие коммерчески доступных in vitro моделей. GHRP каждый вотдельности инкубировали с ферментами фракций в течение 24 ч при 37°С.Описание процедур очистки и анализа полученных реакционных смесейприводится в разделах 2.4.3.3 и 2.4.1, соответственно.
Метаболиты GHRP,полученные в процессе инкубации с различными субклеточными фракциями,представленывТаблице9.Длясравнениявтаблицеприведеныидентифицированные другими авторами метаболиты GHRP.В процессе инкубации с различными субклеточными фракциями намиполучено от 2 до 11 метаболитов для каждого исходного соединения. GHRP,имеющие ненатуральные аминокислотные остатки во втором положении,показали большую устойчивость к воздействию ферментов, в то время как GHRP1 и алексаморелин деградировали в результате гидролиза незащищеннойпептидной связи в первом положении.
Так же было отмечено гидролитическоерасщепление пептидной связи между остатками ненатуральной и D-аминокислотв составе ипаморелина с образованием метаболита ипаморелин (1-3) ОН. НаРисунке 12 в качестве примера приведены масс-хроматограммы по выделеннымионам каждого из метаболитов GHRP-6, полученных при инкубации смикросомальными фракциями почек и печени человека, печеночной S9 фракциейчеловека, а также человеческой сывороткой крови.При инкубации GHRP-6 с печеночной S9 и почечной микросомальнойчеловеческими фракциями образуется большее число метаболитов по сравнениюс сывороткой крови и печеночной микросомальной фракции человека.Аналогичные результаты получены для всех остальных GHRP.
В частности, приинкубацииссубклеточнымифракциямидетектированыметаболиты,соответствующие гидролитическому расщеплению связи Phe―Lys у пептидовGHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелин, алексаморелин и ипаморелин. Послеинкубации исходных соединений с сывороткой человеческой крови данныеметаболиты не детектировали.85БВГОтностельная интенсивность, %АВремя, минРисунок 12 — Масс-хроматограммы по выделенным ионам GHRP-6 и его метаболитов, синтезированных в присутствиисыворотки человеческой крови (А), микросомальной (Б) и S9 фракций печени человека (В), микросомальной фракциипочек человека (Г)86В микросомальной фракции почек человека и печеночной S9 фракциидетектированыметаболитыGHRP-1,GHRP-2,GHRP-6,алексаморелина,гексарелина и ипаморелина с молекулярной массой большей примерно на 1 Да.Подобные метаболиты GHRP-4 и GHRP-5 детектированы не были.
Полученныемасс-спектры фрагментации указывают на увеличение молекулярной массы на1 Да во всей y-серии фрагментных ионов, что соответствует замене NH2-группына ОН-группу С-терминального аминокислотного остатка. В качестве примера наРисунке 13 представлены масс-спектры детектированных метаболитов GHRP-1:GHRP-1 (2-7) NH2 и GHRP-1 (2-7) OH.С-концевым амидированным аминокислотным остатком GHRP-1, GHRP-2,GHRP-6, алексаморелина, гексарелина и ипаморелина является Lys, в составбокового радикала которого входит дополнительная ε-аминогруппа.
На основанииполученных экспериментальных данных выдвинуты две гипотезы увеличениямолекулярноймассыметаболитов на 1 Да:в процессе инкубации смикросомальной фракцией почек и S9 фракцией печени человека происходитреакция дезаминирования по ε-аминогруппе у С6-атома углерода боковогорадикала аминокислотного остатка Lys или реакция дезамидирования поконцевой амидогруппе (Рисунок 14).Первое предположение может подтверждать тот факт, что метаболитыGHRP-4 и GHRP-5, в состав которых не входит Lys, со сдвигом молекулярноймассы на 1 Да детектированы не были.
Однако причиной этого может быть инеспособность использованных метаболических систем катализировать реакциюдезамидирования концевых аминокислот с объемными индольным и фенольнымкольцами боковых радикалов двух С-концевых аминокислотных остатков Trp иPhe у GHRP-4 и GHRP-5.АH110.0719K129.1028y1146.1287KОтносительная интенсивность, %84.08162+[ M+2H]442.7320b2335.1514a2W159.0922307.1563b3406.1888y3479.2769b4a4592.2683y4 564.2723550.3138b4+H2O610.2774a5y5747.3964b5+H2O711.3437757.3431m/zБHK 110.071984.0816KОтносительная интенсивность, %129.1028b2335.1505a2y1b3406.1877307.1553147.1133 W159.09222+y42+[M+2H]443.2258b4276.1710a4592.2666564.2715y3480.2633b5739.3341b4+H2O610.2770y5748.3836m/zРисунок 13 — Масс-спектры метаболитов GHRP-1 (2-7) OH (А) и GHRP-1 (27) NH2 (Б), синтезированных в процессе инкубации с микросомами почекчеловека88АБреакциядезамидированияреакциядезамидированияреакциядезаминированияРисунок 14 — Схемы сайтов отщепления NH2-группы в ходе реакцийдезаминирования или дезамидирования GHRP-6 (А) и GHRP-4 (Б).
Пунктиромвыделен участок полипептидной цепи GHRP-6, характерный для всех лизинсодержащих соединений ряда GHRPК настоящему времени деамидированные метаболиты GHRP такжеидентифицированы несколькими лабораториями [116,117,121]. Впервые вопрос онеобходимости доказательства процесса дезамидирования был поднят в работе[116]. Авторами представлено доказательство на основе разницы интенсивностисигнала при ионизации в положительном и отрицательном режимах сканированиядвух пептидов Trp―Ala―Trp―Phe―Lys-ОН и Trp―Ala―Trp―Phe―Lys-NH2.Исследователямипоказано,чтоинтенсивностьсигналапептидаTrp―Ala―Trp―Phe―Lys-ОН в 10 раз выше, чем амидированного аналога приотрицательнойионизации,чтоуказывалонасвободнуюС-концевуюкарбоксигруппу.В данной работе доказательство дезамидирования строится на основефермент-селективной реакции с использованием рекомбинантной амидазы,которая осуществляет протеолитическое отщепление амидной группы карбоксилаС-концевого аминокислотного остатка.
Стоит отметить, что данный фермент89авторы работы [116] предлагают использовать для получения референсныхстандартов деамидированных метаболитов GHRP без применения технологийхимического синтеза.Для получения деамидированных метаболитов каждый GHRP былпроинкубирован с амидазой при условиях, описанных в разделе 2.4.3.4. Анализполученных реакционных смесей показал, что деамидированные метаболитыGHRP с Lys-концевыми аминокислотными остатками образуются в большемколичестве. Таким образом, деамидированные метаболиты GHRP-4 и GHRP-5,возможно, не детектируются ввиду их небольшого количества, образовавшегося входе инкубаций с различными субклеточными фракциями.
На Рисунке 15представлены масс-хроматограммы по точным массам ионов исходных Lysсодержащих GHRP (GHRP-1 и GHRP-2) и Lys-несодержащего GHRP-4 и ихдеамидированныхметаболитов.Соотношениедеамидированныхметаболитовиинтенсивностейамидированныхисходныхсигналовпептидовзначительно различаются для GHRP-1 и GHRP-2 c С-концевым аминокислотнымостатком Lys и GHRP- 4, у которого С-концевой аминокислотой является D-Phe.Однакообразованиедеамидированныхметаболитов приинкубацииинтактных пептидов с ферментом амидазой не является доказательством процессадезамидирования при инкубации GHRP с субклеточными фракциями.
Дляустановления причины увеличения молекулярной массы метаболитов на 1 Да былвыполнен аналогичный эксперимент с рекомбинантной амидазой и реакционнымисмесями, полученными после инкубации исходных пептидов с фракциями печении почек человека. Для дезактивации протеолитических ферментов субклеточныхфракций полученные реакционные смеси после 24-часовой инкубации прогрелипри 95°С в течение 5 мин. К полученным смесям добавляли фермент амидазу,после чего смеси инкубировали в течение следующих 24 ч при 30°С, согласнопротоколуполучениядеамидированныхрекомбинантной амидазы.90метаболитовсиспользованиемRT: 18.09NL: 6.54E7m/z = 478.2497 (-1.7)GHRP-1Rel.
Ab. (деамид.)зRel. Ab. (амид.)RT: 18.63= 35.14NL: 1.66E9m/z = 478.7423 (-0.4)GHRP-1 (1-7) OHRT: 19.32NL: 2.50E8m/z = 409.7211 (0.2)GHRP-2Rel. Ab. (деамид.)Rel. Ab. (амид.)= 35.14= 5,58RT: 19.63NL: 1.22E9m/z = 410.2129 (-1.3)GHRP-2 (1-6) OHRT: 20.04NL: 1.84E8m/z = 608.2972 (-1.3)GHRP-4Rel. Ab. (деамид.)Rel. Ab. (амид.)RT: 20.64= 0,0027NL: 5.25E5m/z = 609.2834 (2.3)GHRP-4 (1-4) OHРисунок 15 — Масс-хроматограммы по точным массам ионов-прекурсоровинтактных GHRP и их метаболитов, полученных в ходе инкубации срекомбинантной амидазойПри реакции дезаминирования по ε-аминогруппе бокового радикалааминокислотного остатка Lys, как и при дезамидировании по С-карбоксильнойаминогруппы, NH2-группа замещается ОН-группой, что приводит к увеличению91массы на +0.9852 Да [10].
Таким образом, в случае реакции дезаминирования впроцессе инкубации с субклеточными фракциями с последующей инкубацией срекомбинантной амидазой масса полученных дезаминированно-деамидированныхметаболитов GHRP должна быть больше на +1.9704 Да по сравнению сисходными соединениями. На Рисунке 16 в качестве примера представлены массхроматограммы по точным массам GHRP-1 и его деамидированных метаболитовGHRP-1 (1-7) OHидезаминированныхGHRP-1 (2-7) ОН,метаболитоватакжеGHRP-1 (1-7) OHидеамидированноGHRP-1 (2-7) ОН,полученные при анализе инкубационных смесей с S9 фракцией печени ирекомбинантной амидазой.Согласно приведенным масс-хроматограммам, метаболиты GHRP-1 сувеличением молекулярной массы на +1.9704 Да после последовательныхинкубацийссубклеточнымифракциямиирекомбинантнойамидазойдетектированы не были, что указывает на дезамидирующую активностьферментов микросом почек человека и S9 фракции печени человека.В нашей совместной работе с испанской антидопинговой лабораторией поизучению влияния структуры пептидов на аффинность связывания с рецепторомгрелина, экспрессированного на поверхности клеток НЕК-293, показана большаяаффинность амидированных пептидов по сравнению с их деамидированнымианалогами [168].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
