Диссертация (1091769), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Предложено два варианта элюции связавшихся веществ ссорбента: с упариванием элюатов и без, позволяющие сконцентрировать образцыв 5 и 2.5 раза, соответственно. Подробное описание условий пробоподготовкиприведено в п.2.4.4.3. Оценку эффективности предложенных протоколовпробоподготовки образцов мочи проводили при валидации методики.3.2.3 Валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробахмочи методом СВЭЖХ-МС/МСНаоснованииполученныхэкспериментальныхданныхразработанакачественная методика, позволяющая селективно идентифицировать GHRP и ихметаболиты в пробах мочи человека. В соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025[178], Международным стандартом для лабораторий ВАДА [179] и Техническимдокументом ВАДА о минимально требуемых уровнях определения длядетектирования и идентификации не пороговых субстанций [176], при валидацииспособа определения GHRP и их метаболитов с предложенными вариантамипробоподготовки установлены следующие метрологические характеристики:селективность/специфичность, линейность, прецизионность в условиях одногодня и между днями, предел обнаружения, степень извлечения и влияниекомпонентов матрицы (эффект матрицы).3.2.3.1 Селективность/специфичностьВ соответствии с Техническим документом ВАДА [180] по критериямпроведенияхроматомасс-спектрофотометрическиханализовдлякаждогосоединения оценивали специфичность двух и более характеристичных переходов(Таблица 12).
Для этого проводили пробоподготовку 10 образцов мочи, заведомоне содержащих целевых соединений, и образца мочи с концентрацией GHRP и ихметаболитов 2 нг/мл. При отсутствии на сравниваемых участках массхроматограмм пиков, соответствующих временам удерживания определяемых107соединений, с отношением сигнал/шум более или равным 3:1 выбранный ионныйпереход признавался селективным.Согласно полученным результатам, на участках масс-хроматограммсигналов интерферирующих соединений не обнаружено, все выбранные ионныепереходы в режиме мониторинга выбранных реакций характеризуются высокойселективностью.3.2.3.2 Градуировочная зависимостьЛинейность оценивали в диапазоне концентраций 0.5–10 нг/мл (ТФЭ накартриджах) и 2–20 нг/мл (ТФЭ на планшетах для микроэкстракции), по триобразцадлякаждогоконцентрационногоуровня.Заисключениемпробоподготовки без концентрирования после ТФЭ с использованием планшетовдлямикроэкстракции(r2 ≥ 0.895),каждаяградуировочнаязависимостьпродемонстрировала приемлемую линейность с коэффициентами корреляции, какправило, более 0.977 для протокола ТФЭ с использованием планшетов длямикроэкстракции с упариванием, 0.981 и 0.996 при ТФЭ на картриджах приручном доведении рН и разбавлением буферным раствором, соответственно(Таблица 8).3.2.3.3 Прецизионность (в условиях одного дня и между днями)Для оценки прецизионности в условиях одного дня проводили шестьпараллельных анализов мочи с концентрациями GHRP 2 нг/мл (ТФЭ накартриджах) и 10 нг/мл (ТФЭ на плашках для микроэкстракции).
Величинуотносительного стандартного отклонения (sr) прецизионности оценивали пошести точкам с помощью калибровочной прямой с концентрациями целевыхсоединений в диапазоне от 0.5–10 и 2–20 нг/мл при ТФЭ на картриджах ипланшетах для микроэкстракции, соответственно.Для оценки прецизионности между днями проводили анализ серий из шестиобразцов мочи с концентрациями соединений 2 нг/мл (ТФЭ на картриджах) и10 нг/мл (ТФЭ на плашках для микроэкстракции) в течение трех дней (inter-day).Величинуотносительногостандартного108отклонения(sr)прецизионностиоценивали по восемнадцати точкам с помощью калибровочной прямой сконцентрациями целевых соединений в диапазоне от 0.5–10 нг/мл и 2–20 нг/мл,соответственно.Согласнополученнымэкспериментальнымданным,значительного влияния способа доведения рН и устройств для ТФЭ напрецизионность не отмечено (Таблица 13).3.2.3.4 Предел обнаруженияВ соответствии с Техническим документом ВАДА о минимально требуемыхуровнях определения (MRPL) для детектирования и идентификации не пороговыхсубстанций, предел обнаружения процедуры первоначального тестирования недолжен превышать 50% от MRPL, при этом определение данной метрологическойхарактеристики для всех метаболитов веществ не является обязательным.
ДляGHRP минимальный требуемый уровень определения составляет 2 нг/мл [176].Для установления предела обнаружения веществ проводили анализ серий изшести образцов мочи с концентрацией определяемых соединений 0.05, 0.1, 0.2,0.5, 1, 2 и 5 нг/мл (n=6). Пределом обнаружения принимали минимальнуюконцентрацию, при которой соединение достоверно идентифицировалось во всехпробах с соотношением сигнала к шуму более или равным 3 в режимерегистрации выбранных реакций.Пределы обнаружения GHRP и их метаболитов оценивали для каждого изпредложенных протоколов пробоподготовки (Таблица 13).Установленныепределы обнаружения соединений ниже или равны (в случае протокола безконцентрирования элюатов при ТФЭ с использованием планшетов длямикроэкстракции) установленному ВАДА значению MRPL, что соответствуеттребованиям ВАДА к разрабатываемой методике.3.2.3.5 Степень извлеченияОпределениестепениизвлечениясоединенийизмочипроводилисравнением результатов, полученных при анализе 6 образцов мочи с добавлениемGHRP и их метаболитов в пробы до ТФЭ и непосредственно перед109инструментальным анализом в концентрации 2 нг/мл (ТФЭ на картриджах) и10 нг/мл (ТФЭ на плашках для микроэкстракции).За исключением пробоподготовки без концентрирования после ТФЭ сиспользованием планшетов для микроэкстракции, значительного влияния способадоведения рН и устройств для ТФЭ на извлечение не замечено (Таблица 13).3.2.3.6 Влияние компонентов матрицы (эффект матрицы)Для оценки влияния компонентов матрицы (эффекта матрицы) GHRP и ихметаболиты добавляли в воду или концентрат буферного раствора после ТФЭ ваналогичных концентрациях.Согласно полученным результатам, при доведении рН до оптимальногозначения разбавлением проб мочи буферным раствором усиливается влияниекомпонентов матрицы (Таблица 13).110Таблица 13 — Основные метрологические характеристики, полученные при валидации разработанной методики5959604258615762546956495856ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %134059411318183555961292130СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %20.10.050.11220.050.050.20.2110.1ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, пг/мл6/2613/2324/236/116/96/74/826/2128/2626/275/236/1119/2728/270.895ПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст.
откл.,%(intra-day/inter-day)2123141119151520212021251620ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %326175563756477779886162134СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %0.50.10.10.050.20.50.50.050.10.50.20.50.20.2ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, пг/мл3/62/53/41/22/32/32/212/209/1920/211/21/312/1818/210.996на микропланшетах0.25 мл мочи/0.25 мл буф.р-ра 0.25 мл мочи/0.25 мл буф.р-рабез упариванияупаривание в токе N2ПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст. откл.,%(intra-day/inter-day)ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %144755102142221036СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %3564816325232668741470576162ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, пг/мл0.20.050.050.10.10.50.20.050.10.20.10.20.20.2ПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст. откл.,%(intra-day/inter-day)ЭФФЕКТ МАТРИЦЫ, %GHRP-12/2GHRP-23/5GHRP-46/5GHRP-550/50GHRP-63/2Алексаморелин5/3Гексарелин1/1Ипаморелин1/1GHRP-1 (3-7) NH213/19GHRP-2 (1-3) OH16/19GHRP-6 (2-6) NH21/2GHRP-6 (2-5) OH3/8Гексарелин (1-3) OH19/18Ипаморелин (1-4) OH 14/16ЛИНЕЙНОСТЬ(общ.) 0.981СТЕПЕНЬ ИЗВЛЕЧЕНИЯ, %СоединениеПРЕЦИЗИОННОСТЬ, ст.
откл.,%(intra-day/inter-day)Условия ТФЭПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ, пг/млна картриджах1 мл мочи0.5 мл мочи/0.5 мл буф. р-раупариваниеупаривание11/2016/188/124/58/95-66/618/2225/2221/233/62/39/1626/230.97710.10.050.20.2110.050.050.20.10.50.20.052663675558596371701074221424504725736364120411532314253.3 Апробация методики определения GHRP и их метаболитов в пробахмочи методом СВЭЖХ-МС/МС3.3.1 Количественная оценка наиболее интенсивных и долгоживущихметаболитов GHRP в образцах мочиРасчет концентраций исходных соединений GHRP и их метаболитов вобразцах мочи проводили по калибровочным прямым соответствующихстандартов. Ввиду отсутствия стандарта метаболита GHRP-1 (2-4) ОН, егоконцентрацию в пробах мочи рассчитывали по калибровочной прямойгексарелина (1-3) ОН с похожими ароматическими заместителями у двухаминокислотных остатков и близким временем удерживания.
На Рисунке 20представлены временные профили концентраций исходных соединений и ихметаболитов после приема пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина иипаморелина здоровыми волонтерами мужского пола.Из представленных графиков очевидно, что выявление злоупотребленияGHRP-1 возможно только по его метаболитам с пиком максимальной ихконцентраций через 7.5 ч после приема. Наиболее долгоживущим метаболитомявляется GHRP-1 (2-4) ОН, который детектировали в образцах мочи в течение27 ч после приема (Рисунок 20) .GHRP-2, GHRP-6, гексарелин и ипаморелин характеризуются схожимипрофилями выведения с максимальными концентрациями в течение первых 5 чпослеприема.соединенийМаксимальныенаблюдаютсявпикитечениеконцентраций5-15 чметаболитовпосле приема.данныхВыявленныедеамидированные метаболиты GHRP-6 (1-6) ОН и GHRP-6 (2-6) ОН в образцахмочи волонтеров после назального приема препаратов ранее описаны не были.Показано,чтоипаморелининтенсивнометаболизируетсобразованиемметаболита ипаморелин (1-4) ОН в сопоставимых с исходным соединениемконцентрациях.
Данный метаболит детектируется до 37 ч после приема приотсутствии сигнала исходного пептида (Рисунок 21) .0.350.0350.02540.0230.01520.0110.0050005101520 25 30Время, ч354045GHRP-2GHRP-2 (1-3) OH7066055044033022011000Г101520 25 30Время, ч354045GHRP-6GHRP-6 (2-5) OHGHRP-6 (2-6) NH283503007250652004150310025010Концентрация GHRP-6, нг/мл59Концентрация гексарелина, нг/млВКонцентрация метаболитов GHRP-6, нг/мл0005101520 25 30Время, ч354045гексарелингексарелин (1-3) OH 2014016120100Д1280860404200005101520 25 30Время, ч35 4045ипаморелинипаморелин (1-4) OH5Концентрация, нг/млКонцентрация GHRP-1 (3-7) NH2, нг/мл60.04Концентрация GHRP-2 (1-3) ОН, нг/млКонцентрация GHRP-1 (2-7) NH2и GHRP-1 (2-4) OH, нг/млGHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1 (2-4) OH7Концентрация гексарелина (1-3) ОН, нг/млБКонцентрация GHRP-2, нг/млА4321005101520 25 30Время, ч354045Рисунок 20 — Профили концентраций GHPR и их метаболитов в моче послеразового назального приема волонтерами GHRP-1 (А), GHRP-2 (Б), GHRP-6 (В),гексарелина (Г) и ипаморелина (Д)113не детектируетсянеGHRP-1GHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (2-4) OHGHRP-1 (3-7) NH2GHRP-2GHRP-2 (1-3) OHGHRP-6GHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-5) OHГексарелинГексарелин (1-3) OHИпаморелинИпаморелин (1-4) OH05101520253035404550Окно детектирования, чРисунок 21 — Окно детектирования некоторых представителей класса GHRP и ихметаболитов в моче после назального приемаНаиболее широкое временное окно детектирования имеет GHRP-2, которыйвместе со своим метаболитом GHRP-2 (1-3) ОН детектировали в течение 47 чпосле приема пептида.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
