Диссертация (1091769), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Полный катаболизм GHRP-1 иалексаморелина, в отличие от остальных представителей класса GHRP по мнению78авторов [6,7] происходит за счет присутствия незащищенной искусственнымиаминокислотами пептидной связи Ala―His в первом положении.Дляопределенияэффективностимодельнойсистемыin vitroсиспользованием сыворотки человеческой крови в качестве матрицы использовалисмесь сыворотки крови здоровых мужчин и женщин, взятых в равныхсоотношениях.
Каждый из исходных GHRP инкубировали с сывороткой в течение24 ч при условиях, описанных в разделе 2.4.3.2. После пробоподготовкиинкубационных смесей путем осаждения органическим растворителем мажорныхбелков, образцы анализировали методом наноВЭЖХ-МСВР в режиме tSIMtMSMS.Анализ полученных образцов показал, что основным катаболическимпроцессом для соединений класса GHRP является протеолитическая деградация.Присутствие исходных соединений GHRP-1 и алексаморелина в следовыхколичествах коррелирует с другими публикациями [6,7], в которых описанаполная деградация данных пептидов с образованием амидированных метаболитовGHRP-1(2-7) NH2,GHRP-1(3-7) NH2иалексаморелина(2-7) NH2.Идентификация пептидов GHRP-1 и алексаморелина в интактном виде можетобъясняться высокой чувствительностью методов анализа и/или избыткомисходных соединений в реакционных смесях.
Таким образом, для GHRP-1,алексаморелина и GHRP-5 превалирует N-концевое направление метаболическойдеградации, в то время как для остальных исследованных GHRP – С-концевое.Анализсайтовпротеолитическогогидролизапоказалприсутствиедополнительной уязвимой пептидной связи между аминокислотными остаткамиL-Ala и Trp [5]. Метаболиты, идентифицированные после инкубации GHRP сплазмой крови человека, представлены в Таблице 9.79Таблица 9 — Элементный состав, точные массы ионов-прекурсоров исходных пептидов и метаболитов,синтезированных в условиях in vitro в присутсвии человеческой сывороткой крови (СКЧ), микросомальными фракциямипочек и печени (HKM и HLM, соответственно) и S9 фракцией печени человека (S9)Ala-His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-Trp-OHHis-(D-β-Nal)-Ala-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHTrp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-(D-Phe)-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-Trp-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-OH(D-Ala)-(D-β-Nal)-Ala-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2C51H62N12O7C51H61N11O8C48H57N11O6C48H56N10O7C42H44N8O6C33H35N7O5C30H30N6O4C42H50N8O5C42H49N7O6C36H37N5O5C26H35N5O4C26H34N4O5C45H55N9O6C45H54N8O7C42H50N8O5C42H49N7O6C39H42N6O6C30H33N5O5C19H23N3O4C19H24N4O3C29H40N7O4478.25052+478.74252+442.73192+443.22392+757.3457+610.2772+424.1979+374.20252+374.69452+620.2873+479.2765+480.2605+409.72102+410.21302+747.3977+748.3817+691.3239+544.2554+358.1761+357.1801+550.3136+80++++++++++++++++ИсточникиS9Ионпрекурсор,m/zHLMБруттоформулаHKMGHRP-1GHRP-1 (1-7) OHGHRP-1 (2-7) NH2GHRP-1 (2-7) OHGHRP-1 (2-6) OHGHRP-1 (2-5) OHGHRP-1 (2-4) OHGHRP-1 (3-7) NH2GHRP-1 (3-7) OHGHRP-1 (3-6) OHGHRP-1 (5-7) NH2GHRP-1 (5-7) OHGHRP-2GHRP-2 (1-6) OHGHRP-2 (2-6) NH2GHRP-2 (2-6) OHGHRP-2 (1-5) OHGHRP-2 (1-4) OHGHRP-2 (1-3) OHGHRP-2 (1-3) NH2GHRP-2 (3-6) NH2Аминокислотная последовательностьСКЧСоединениеСубклеточнаяфракция+++++++++[6,7,116,117,121,165][6,116,121,165][116,165][165][6,116,165][116,165][116,165]++++++++++++++++++++++++[6,7,116,117,121,147,165][116,117,121,165][117][116,117,147,165][7,116,117]+++[117]Продолжение Таблицы 9GHRP-2 (3-6) OHGHRP-2 (4-6) NH2GHRP-2 (4-6) OHGHRP-4GHRP-4 (1-4) OHGHRP-4 (2-4) NH2GHRP-4 (1-3) OHGHRP-5GHRP-5 (2-5) NH2GHRP-5 (3-5) NH2GHRP-5 (2-4) OHGHRP-5 (1-3) OHGHRP-6GHRP-6 (1-6) OHGHRP-6 (2-6) NH2GHRP-6 (2-6) OHGHRP-6 (1-5) OHGHRP-6 (2-5) OHGHRP-6 (1-4) OHGHRP-6 (1-3) OHGHRP-6 (3-6) NH2GHRP-6 (4-6) NH2GHRP-6 (4-6) OHAla-Trp-(D-Phe)-Lys-OHTrp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHAla-Trp-(D-Phe)-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-OHTyr-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-NH2Tyr-(D-Trp)-Ala-Trp-OHTyr-(D-Trp)-Ala-OHHis-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OH(D-Trp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Trp)-Ala-Trp-OHHis-(D-Trp)-Ala-OHAla-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-OHC29H39N6O5C26H35N5O4C26H34N4O5C34H37N7O4C34H36N6O5C23H27N5O3C25H27N5O4C43H46N8O6C34H37N7O4C23H27N5O3C34H36N6O6C23H26N4O5C46H56N12O6C46H55N11O7C40H49N9O5C40H48N8O6C40H43N9O6C34H36N6O5C31H34N8O5C20H24N6O4C29H40N7O4C26H35N5O4C26H34N4O5551.2976+479.2765+480.2605+608.2980+609.2820+422.2190+462.2136+771.3613+608.2980+422.2190+625.2769+439.1976+437.22962+437.72162+736.3929+737.3770+746.3409+609.2820+599.2725+413.1932+550.3136+479.2765+480.2605+81++++++++ИсточникиS9Ионпрекурсор,m/zHLMБруттоформулаHKMАминокислотная последовательностьСКЧСоединениеСубклеточнаяфракция++++[117][6,7,116][116]+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++[116][116][6,7,116][6,116][116][116][6,7,116,117,121,165][116,117,121,165][116,117,165][116,165][116,117,165][117]+++++[117]Продолжение Таблицы 9ГексарелинГексарелин (2-6) NH2Гексарелин (2-6) OHГексарелин (2-5) OHГексарелин (1-5) OHГексарелин (1-4) OHГексарелин (1-3) OHГексарелин (3-6) NH2Гексарелин (3-6) OHГексарелин (4-6) NH2Гексарелин (4-6) OHАлексаморелинАлексаморелин (1-7) OHАлексаморелин (2-7) NH2Алексаморелин (2-7) OHАлексаморелин (2-6) OHАлексаморелин (2-5) OHАлексаморелин (3-7) NH2Алексаморелин (3-7) OHАлексаморелин (4-7) NH2Алексаморелин (4-7) OHАлексаморелин (5-7) NH2Алексаморелин (5-7) OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OH(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-OHHis-(D-Mrp)-Ala-OHAla-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHTrp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-OHAla-His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-OHHis-(D-Mrp)-Ala-Trp-OH(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2(D-Mrp)-Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHAla-Trp-(D-Phe)-Lys-NH2Ala-Trp-(D-Phe)-Lys-OHTrp-(D-Phe)-Lys-NH2Trp-(D-Phe)-Lys-OHC47H58N12O6C41H51N9O5C41H50N8O6C35H38N6O5C41H45N9O6C32H34N8O5C21H26N6O4C29H40N7O4C29H39N6O5C26H35N5O4C26H34N4O5C50H63N13O7C50H63N12O8C47H58N12O6C47H57N11O7C41H45N9O6C32H36N8O5C41H51N9O5C41H50N8O6C29H40N7O4C29H39N6O5C26H35N5O4C26H34N4O5444.23742+375.70792+376.19992+623.2982+380.68192+613.2881+427.2088+550.3136+551.2976+479.2765+480.2605+479.7571+480.2501+444.23932+444.73122+380.68162+613.2875+750.4075+751.3918+550.3136+551.298+479.2753+480.2592+82+++++++ИсточникиS9Ионпрекурсор,m/zHLMБруттоформулаHKMАминокислотная последовательностьСКЧСоединениеСубклеточнаяфракция+++[6,7,116,117,121,165][116,117,165][116,165][116,165]+++++++++++++++++++++++++++++++[165][117,121]+++++++++++++++++++++[117,121][6,7,116][6,116][116]Продолжение Таблицы 9Aib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2Aib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-OHHis-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-OHAib-His-(D-β-Nal)-(D-Phe)-OHAib-His-(D-β-Nal)-OH(D-β-Nal)-(D-Phe)-Lys-NH2C38H49N9O5C38H48N8O6C34H42N8O4C34H41N7O5C32H36N6O5C23H27N6O4C28H35N5O3356.70012+357.19212+314.17372+314.66572+293.14462+219.61042+245.64432+83+++++++++++++ИсточникиS9Ионпрекурсор,m/zHLMБруттоформулаHKMИпаморелинИпаморелин (1-5) OHИпаморелин (2-5) NH2Ипаморелин (2-5) OHИпаморелин (1-4) OHИпаморелин (1-3) OHИпаморелин (3-5) NH2Аминокислотная последовательностьСКЧСоединениеСубклеточнаяфракция+++++++[6,7,116,121,165][116,121,165][121][116,165][116]3.1.3 Субклеточные фракцииСогласно литературным данным [166], трансформация биоактивныхвеществ происходит в разных органах организма: почках, коже, легких икишечнике,средикоторыхпеченьсчитаетсяцентральнымбиотрансформирующим органом, особенно для низкомолекулярных соединений смолекулярной массой ˂1-2 кДа.
Однако деградация пептидных соединенийпротекает в основном в почках и крови [116,155]. Способ и режим приемапептидных препаратов, форма выпуска препарата и другие факторы могут влиятьна локализацию метаболизма соединений. Поэтому особый интерес представлялосравнение синтезированных ткане-специфических метаболитов GHRP и оценкабиотрансформирующего потенциала каждой из выбранных модельных системin vitro.В статье [167] описан метаболизм in vitro µ-селективных тетрапепдтидныхопиоидов, сходных по структуре с GHRP. По результатам инкубации сразличными тканями и субклеточными фракциями крыс показано, что почечнаяткань обладает наибольшей метаболической активностью.
Основными путямиэлиминации тетрапептидов были гидролиз пептидных связей, дезамидирование Сконцевого амида и отщепление N-концевого аминокислотного остатка тирозина.В статье [121] после инкубации GHRP с S9 фракцией печени лошадиидентифицированы метаболиты, образованные в результате последовательногорасщепления пептидной связи с N-конца и дезамидирования.В настоящее время появились данные по изучению метаболизма GHRP-2,GHRP-6 и гексарелина в присутствии S9 фракций печени и почек человека ипеченочных микросом [117]. В процессе инкубации с субклеточными фракциямипечени метаболиты образовывались в результате гидролиза пептидных связей, вто время как дезамидирование С-концевой амидной группы не наблюдалось.Данные о метаболитах, образующихся при инкубации с S9 фракцией почек,авторами статьи не приведены.В данной работе в качестве in vitro моделей для получения метаболитовGHRP выбраны микросомальные фракции печени и почек человека и S9 фракция84печени человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
