Диссертация (1091769), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При присоединении биоактивного пептида кальбумину увеличивается общая молекулярная масса комплекса, в результатечего пептид не выводится из организма посредством почечной клубочковойфильтрации. Кроме того, значительный вклад в увеличение периода полураспадаассоциированного белка вносит связывание альбумина с неонатальным Fcрецептором [120]. Классическими примерами увеличения стабильности белковацилированием являются лираглутид и детемир (торговое название Левемир®,NovoNordisc).
Детемир представляет собой аналог инсулина длительногодействия, в котором С-концевым аминокислотным остатком В-цепи являетсяацилированныймиристиновойкислотойлизин(Lys B29).Присоединениедетемира к альбумину через остаток жирной кислый увеличивает период егополураспада до 5-7 ч [88].N-концевое ацилирование фрагмента (17-23) тимозина β4 (торговоеназвание ТВ-500), разработанного для применения в ветеринарных целях,защищает соединение от карбоксипептидаз, как это было показано в ряде работпо изучению метаболизма ТВ-500 с использованием различных модельныхсистем in vivo и in vitro [117,121,122].Существенным ограничением применения ацилирования для защитысоединенийпептиднойприродыотэкзопептидазявляетсяотсутствиеконформационной стабильности концевых областей биомолекулы, что можетсказываться на ее активности.
Альтернативной стратегией модифицированиябелков и пептидов является гибридизация белков с N- или С-концевым белкомносителем в виде самого альбумина или высоко аффинных к нему молекул, в томчисленебольшихразмеров.Недостаткомпотенциальная иммуногенность [123].39даннойстратегииявляется1.3 Методы изучения метаболизма соединений пептидной природыПонимание основных направлений метаболизма соединений необходимо вомногих областях: фармакологической индустрии, при разработке лекарств,судебно-медицинской экспертизе, антидопинговом контроле [124]. Исследованияпо метаболизму различных соединений состоят из двух этапов: получение самихметаболитов исходных соединений и их последующей идентификации.
Дляполученияметаболитовстараютсяиспользоватьмаксимальносложныемодельные системы, включающие различные ферменты такие, как протеазы,глюкуронидазы, трансферазы и кофакторы. Использование многокомпонентныхмодельных систем позволяет учитывать сложность человеческого организма длянаболее близкой картины о происходящих процессах биотрансформации. Взависимости от задач и целей исследования для изучения метаболизмасоединенийпептиднойприродыиспользуютсяразличныемоделиианалитические методы, наиболее распространенные из которых будут описаныниже.1.3.1 Биологические модели изучения метаболизмаДля изучения метаболизма используются различные модели in vivo, in vitroи in silico. Методы in vivo (от лат. «в (на) живом») представляют собой модельпроведения экспериментов с участием различных видов животных или человекадля изучения основных фармакологических и фармакодинамических свойствсоединений: поглощения, распределения, метаболизма и выведения.
Этот подходявляется наиболее эффективным методом, поскольку отражает влияние всехорганов организма человека или животного на биотрансформацию исследуемоговещества.Изучениеметаболизмаin vivoявляетсянеотъемлемойчастьюразработки новых лекарственных препаратов. Однако, он обладает рядомограничений этического и экономического характера, требует больших денежныхинвестиций, является трудо- и время-затратными.
Результаты, полученные вэкспериментахнаразличныхвидахживотных,экстраполировать на человеческий организм [124,125].40нельзяполностьюМетоды in vitro (от лат. «в пробирке, стекле») представляют собой модельпроведенияэкспериментовсприменениемразличныхкультурклеток,бесклеточных систем или микроорганизмов. Модели in vitro, как правило,являютсявысокопроизводительнымиопределенногосвойствабиотрансформационныхиэффективнымисоединенияпроцессовегоилидляизученияорган-специфическихметаболизма,характеризуетсядешевизной, простотой выполнения по сравнению с методами in vivo [126].В качестве модельных систем используют культуры клеток, гепатоциты,фрагменты печени, гомогенаты тканей, субклеточные фракции и изолированныеферменты [127–129].
Наиболее популярными in vitro моделями для изученияметаболизма являются сыворотка крови, микросомальные фракции и гепатоцитыпечени [130]. Гепатоциты печени представляют собой наиболее эффективнуюплатформу in vitro для изучения метаболизма, наиболее приближенную к in vivoпо сравнению с другими популярными моделями. Однако использованиегепатоцитов для моделирования процессов биотрансформации ограничиваетсясложностью обращения с ними, труднодоступностью ввиду непродолжительнойстабильности в случае первичных и культивированных гепатоцитов илинеобходимостьювособыхусловияххраненияиобращенияскриоконсервированными гепатоцитами [128].Микросомальнаяфракцияпредставляетсобойгетерогеннуюсмесьмембранных структур эндоплазматического ретикулума, полученную путемдифференциальногоцентрифугированиягомогенатовразличныхклеток.Микросомы печени человека наиболее часто используются в исследованияхметаболизмаивзаимодействияразличныхбиоактивныхсоединений.Преимуществами микросом являются простота использования, относительнаядешевизна и сохранение ферментативной активности в течение нескольких летпритемпературе-80°С.Микросомыпеченихарактеризуютсявысокойферментативной активностью и высоким содержанием ферментов первой фазыбиотрансформации соединений в организме человека: цитохрома Р-450, гидролаз,эстераз и так далее.
Печеночная S9 фракция, получаемая в результате41центрифугирования при низких скоростях, включает микросомальную ицитозольную фракции. S9 фракция наиболее полно отображает метаболическиепроцессы первой и второй фаз метаболизма. Главным ее недостатком являетсянизкаяферментативнаяактивностьпосравнениюсмикросомамиилицитозольной фракцией, в результате чего некоторые метаболиты не могут бытьполучены с ее использованием [128].На основе моделей in vivo и in vitro применяются биологические методыанализа, заключающиеся в измерении биологической активности исследуемогосоединения по величине, специфичности и функциональности биологическогоответа [131].
При использовании моделей in vivo и in vitro исследуемыесоединения вводятся животному или непосредственно в клеточные и тканевыелинии, соответственно [132,133]. Однако биологические методы, как правило, необладают селективностью для четкого различия исходных пептидных соединенийот их метаболитов. Таким образом, биологические методы показывают толькоответ на присутствие/отсутствие биоактивного соединения, но не дают никакойинформации о структуре веществ.Альтернативный подход предсказания возможных метаболитов соединения,набирающий популярность в последнее время, - компьютерное моделированиеin silico [134].
Данный способ характеризуется высокой производительностью,дешевизной, быстротой и простотой по сравнению с подходами in vitro иin vivo [135]. Однако, in silico подход не может полностью заменить реальныйэкспериментввидуотсутствияубедительныхпримеровдостоверностипредсказаний в литературных источниках [136–138].1.3.2 Аналитические подходы идентификации метаболитовПосттрансляционные и химические модификации белков и пептидовобуславливают разнообразие процессов их биотрансформации и образующихсяметаболитов, что осложняет изучение метаболизма [5]. Для изучения метаболизмасоединенийпептиднойприродыприменяютсяразличныеметоды:иммунологические, хроматографические, масс-спектрометрические (МС), ядерно42магнитного резонанса и другие, среди которых масс-спектрометрическиеявляются наиболее мощными и эффективными [5,139].В настоящее время иммуноанализ представляет собой один из наиболеераспространенныханалитическихметодовколичественногоиполуколичественного определения соединений, характеризующийся высокимиспецифичностьюобеспечениемиселективностью,[5,140].Принципсравнительноколичественногонедорогимопределенияприборнымвеществаиммунохимическими методами анализа основывается на связывании антитела иантигена – самогоисследуемогосоединения[5].Определениеколичествавещества в свободном состоянии или в комплексе проводится по специальновведенной «метке», в качестве которой могут использоваться радиоактивныйизотоп (радиоиммунный анализ, РИА), фермент (иммуноферментный анализ,ИФА) или флюорофор (флуороиммунологический анализ, ФИА).
В случаевведения метки не только в лиганд, но и в антитело, метод носит названиеиммунометрического [3]. Иммунохимические методы анализа начали развиватьсяв 1970-ых годах, среди которых РИА был одним из первых. Принцип РИАзаключается в конкурентном связывании изотопно меченного антигена (трейсер)и неизотопно меченого антигена с антителом. Количество анализируемогосоединения определяется по калибровочной прямой по величине сигналамеченного антигена-трейсера (обратная зависимость).
Одной из модификацийтакого вида анализа является «сандвич»-метод, при котором используются дваразличных вида антител, заключающие между собой молекулу определяемогосоединения. Оба вида антител взяты в избытке, одно из них – имеет «метку», повеличинесигналакоторойколичественноопределяютконцентрациюисследуемого вещества (прямая зависимость) [3]. Существенными ограничениямиприменения иммунохимических методов для изучения метаболизма белков ипептидов является неселективность для дифференциации исходного соединенияпептидной природы и его метаболитов, невозможность детекции пептидов саминокислотной последовательностью менее 4 аминокислотных остатков,минимально необходимых для связывания с эпитопом антитела и ограниченность43специфических антител, особенно для веществ, находящихся на ранних стадияхразработки [141,142]. Данный метод не дает информации о полной структурелиганда, но может использоваться для оценки констант связывания и изученияфармакокинетических характеристик при наличии референсного образца.Масс-спектрометрический(МС)методанализаявляетсянаиболеераспространенным в настоящее время для изучения метаболизма веществпептидной природы [139,143].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
