Диссертация (1091621), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Хроматограммы суммарных липидов, экстрагированных избиомассы бактерий R. erythropolis Х5 (а) и R.erythropolis S67 (б).Подвижная фаза: хлороформ – метанол – вода (65:25:4). 1 - реактивВаськовского; 2- раствор перманганата калия; 3 – α-нафтольный реагент.79Результаты качественного анализа липидов представлены в таблицах13 и 14.Таблица 13. Результаты качественного анализа липидов из биомассыбактерий R.
erythropolis Х5, выращенных на н-гексадекане при 10°С и при26°СRfR. erythropolis Х5 при 10°СR. erythropolis Х5 при 26°С10,150,260,290,350,490,540,600,650,660,720,750,810,840,9423++1+23++++++++++СФ+СФ+++++++++Таблица 14. Результаты анализа хроматограмм липидов из биомассыбактерий Rhodococcus sp. S67, выращенных на н-гексадекане при 10°С ипри 26°СRfR.erythropolis S67 при 10°СR. erythropolis S67 при 26°С123+120,180,30+++0,33+0,45+++0,55+++0,67++СФ++0,730,76++0,85+0,93++1- реактив Васьковского; 2 - раствор перманганата калия;нафтольный реагент, СФ- сине-фиолетовая.803+++СФ3 – α-В смеси липидов, выделенных из бактерий штаммов X5 и S67,присутствуют определяемые липидные компоненты.
На хроматограммахвсехобразцов,проявленныхнафтольнымреагентом,проявляетсякомпонент с Rf 0,6 сине-фиолетового цвета, который характерен длягликолипидов.Этосвидетельствуетоприсутствиигликолипидов,связанных с оболочкой клетки бактерий родококков при росте на нгексадекане,вгликолипидныехроматограммеокрашенныевтомчислеэтобиосурфактантывэтихбурыйусловияхцветмогутбытьклеточносвязанные(биосурфактантыприсутствуюткомпоненты,эндотипа).менеекоторыенеНаподвижныеявляютсягликолипидами, но могут проявляться в присутствии нафтольного реагента(рисунок 20а -3; 20б - 3).Обработкахроматограммперманганатомкалияпозволилаобнаружить непредельные липидные компоненты в смеси.
Однакокоэффициент удерживания этих соединений (Rf имеет значение близкое к1) не позволяет отнести их к мембранным (полярным) липидам.Предположительно, этими компонентами могут быть триацилглицеролы,которые могут накапливатьсяся в клетках родококков при росте нагидрофобных субстратах в виде неполярных включений (п.3.5), илижирныекислоты–промежуточныеметаболитыбиодеградациигексадекана.
Следует отметить, что непредельные соединения проявляютсяна хроматограмме интенсивнее из образцов, которые выделяли избактерий, выращенных при 10оС, чем при 26оС. Это согласуется сизвестной способностью бактерий синтезировать больше непредельныхжирных кислот при пониженной температуре.3.4.2 Содержание связанного гексадекана в биомассе бактерий ижирнокислотный состав клеточных липидовВсоставобщихлипидоввходятмембранныелипидыивнутриклеточные липиды, которые могут образовывать электронно81прозрачные включения в цитоплазме клеток (п.3.5).
Эти включения, поразным данным, могут представлять собой жиры [112], воска [167] или нгексадекан [96,168]. Косвенно определиться с составом включений можнопо содержанию клеточносвязанного гексадекана и жирных кислот вклеточныхлипидах.Газохроматографическийанализпозволилобнаружить н-гексадекан в биомассе микроорганизмов. Содержаниесвязанного гексадекана в клетках S67 больше, чем у X5 как при комнатной(144мкг/гбиомассы и 51мг/гбиомассы соответственно), так и при пониженнойтемпературе культивирования (49мкг/гбиомассы и 7мкг/гбиомассы) (табл.15).Эти значения малы по сравнению с общим содержанием липидов (около0,01 – 0,02%), поэтому маловероятно, что включения представляют собойнакопления гексадекана в клетках. Остаточные количества углеводорода вмассе липидов можно объяснить удерживанием его в клеточной стенкебактерий.
При пониженной температуре содержание гексадекана в клеткахбактерий уменьшается, что, вероятно, обусловлено твердым агрегатнымсостоянием алкана при 10оС, что затрудняет его связывание с клеточнойстенкой бактерий. В то же время, Ким с соавт. [96] при изучениитранспорта и накопления н-алканов в клетках R erythropolis S+14Heпоказали, что после 3-ех суток культивирования бактерий на н-гексадекане(1%, по объему) при 28оС содержание связанного н-гексадекана составило166мкг/г (влажной биомассы). Эти данные сопоставимы с данными,полученными в нашей работе. Авторы предположили, что электроннопрозрачныезакругленныевключения,представляют собой капли гексадекана.82обнаруженныевклетках,Таблица 15.
Содержание липидов, жирных кислот и н-гексадекана вбиомассе бактерий (мг/г)Содержание жирных кислот, мг на г влажнойбиомассыR. erythropolis X5R. erythropolis S67НазваниеСодержаниеобщихлипидов, мгМетиловые эфиры жирныхкислот, мгСуммарноесодержаниежирных кислот, мгГексадекан, мг/гСодержаниеобщихлипидов, мгоооо26 С10 С26 С10 С115169941448111866105760.0701110.051620.049990.144Для проверки этой гипотезы мы определяли общее содержаниежирных кислот и их состав в биомассе бактерий.
Для этого проводилиметанолиз выделенных из биомассы липидов, определяли общую массуметиловых эфиров жирных кислот и их состав методом газовойхроматографии, рассчитывали суммарное содержание жирных кислот наоснове их соотношений в смеси. Получили, что содержание жирныхкислот на три порядка больше, чем содержание гексадекана (табл.15), в товремя как соотношение жирных кислот к гексадекану в работе Кима [96]было близко к единице. На этом основании мы предполагаем, чтолипидные включения в клетках бактерий S67 и X5, обнаруженные нами(п.3.5),представляютсобойтриацилглицериды,анегексадекан.Обсуждения других работ, где включения это жиры, воска [112] [167]Таким образом, в настоящее время нет окончательного решения о составелипидных включений, формирующихся в клетках бактерий при росте нагидрофобных субстратах.Анализ жирнокислотного состава клеточных липидов показал, чтоосновным компонентом является гексадекановая кислота - промежуточныйметаболит н-гексадекана (36% при 26оС и 31% при 10оС для штамма X5;52% при 26оС и 33% при 10оС для штамма S67) (табл.
16). При83пониженной температуре R. erythropolis X5 синтезировали большененасыщенных жирных кислот (33% от общего состава) (табл. 16, рис. 20).Бактерии R. erythropolis S67 при 10оС синтезировали разветвленныежирные кислоты (37% от общего состава), в то время как содержаниененасыщенных жирных кислот отличалось незначительно от содержанияэтих кислот при 26оС (табл. 16, рис.
20). Кроме того, при пониженнойтемпературе Rhodococcus sp. S67 характеризуются более широкимспектром жирных кислот, чем при 26оС.Таблица 16 Жирно-кислотный состав клеточных липидов R. erythropolisX5 и R. erythropolis S67 при росте на н-гексадеканеЖирные кислотыСостав, %Штамм X5Штамм S6726оС10оС26оС10оСНасыщенная неразветвленнаяОстановая-4-Декановая-8-6Додекановая6456Тетрадекановая13915-Пентадекановая10-Гексадекановая36315233ГептадекановаяСумма96556814512-метил-тридекановая-1114-метил-гексадекановая-14-12Насыщенная разветвленная15-Метил-гексадекановая12114-4-диметил-гексадекановаяСумма121103723331918Ненасыщенная9-гексадеценовая84Другими авторами было продемонстрировано, что при пониженнойтемпературе содержание ненасыщенных и метил-разветвленных жирныхкислотувеличивается[169][5].Этосоответствуетрезультатам,полученным нами.
Таким образом, в своей работе еще раз подтвердили,что одним из механизмов адаптации родококков к условиям холодногоклимата является изменение жирнокислотного состава клеточных липидов.3.4.3 Жирнокислотный состав внеклеточных липидовЖирнокислотныйсоставвнеклеточныхлипидныхэкстрактованализировали методом ГХ/МС после переэтерификации метанолом. Врезультате анализа показано, что в липидных экстрактах присутствует ряджирных кислот с длиной цепи от С8 до С18 (рис. 21, рис. 22). Следуетотметить, что декановая кислота является преобладающей жирнойкислотой в липидных экстрактах как при 26оС, так и при 10оС. В экстрактетакже обнаруживается и гексадекановая кислота (около 25% - для штаммаS67; 5% - для штамма X5), которая является промежуточным метаболитомн-гексадекана.85Рисунок 21.
Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот,входящих в составе внеклеточных биосурфактантов, продуцируемыхштаммами X5 при росте на н-гексадекане (а – 26оС; б – 10оС)86Рисунок 22. Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот,входящих в составе внеклеточных биосурфактантов, продуцируемыхштаммами S67 при росте на н-гексадекане (а – 26оС; б – 10оС)В работе [104] продемонстрировано, что липидный экстракт изклеточной культуральной среды бактерии R.ruber при росте на нгексадекане содержит жирные кислоты С11 – С22 (в том числе насыщенные,ненасыщенные и разветвленные), при этом наибольшее содержание имеетгексадекановая кислота. Peng с соав. [36] определяли жирнокислотныйсостав липопептидных биосурфактантов, продуцируемых бактериямиRhodococcus sp.
TW53. В результате анализа показано, что длина цепижирных кислот находится в пределе от С14 до С19 и насыщенные жирныекислоты составляют 81,44% общего содержания. Главной жирнойкислотой является гексадекановая (58,62%). При изучении липидов,87продуцируемых бактериями R. erythropolis 3C-9 в культуральную средупри росте на н-гексадекане Peng с соавт. [65] обнаружили внеклеточныегликолипиды с остатками жирных кислот от С10 до С18, в то время каксодержание кислоты С16 составило около 65%. Кроме этого, бактерииштамма 3С-9 продуцировали в культуральную среду свободные жирныекислоты от С10 – С22.
Следует отметить, что во внеклеточных липидныхэкстрактах бактерий родококков преимущественно содержатся цепижирных кислот с четным числом атомов углерода. Наши результаты ипредставленные литературные данные свидетельствуют о том, чтокатаболическиепревращениягексадекананачинаютсяужевоколоклеточном пространстве, возможно в клеточной стенке или мембранемикроорганизмов.3.5.МорфологияиультраструктурнаяорганизацияклетокR. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при росте на гексадекане3.5.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
