Диссертация (1091621), страница 15
Текст из файла (страница 15)
30а). Поскольку разница вмассах между соседними сигналами составляет 28 Да, что соответствуетмолярной массе двух метиленовых групп (-CH2-), можно предположить,что эти три вещества являются гомологами. Интенсивность пика m/z 899почти в 2,5 раза и 10 раз больше, чем интенсивность сигналов m/z 871 и m/z927, соответственно. Молекулярные массы ионов в масс-спектрах,полученных в условиях регистрации отрицательных ионов, соответствуюттем же молекулярным массам соединений (848, 876 и 904Да) (рис. 30б).97Рисунок 30. Масс-спектры аддуктов гликолипида, выделенного изнеочищенных биосурфактантов методом колоночной хроматографии, вусловиях положительных (а) и отрицательных (б) зарядов.Ранее в нашем научном коллективе выделили гликолипидныйкомпонент из липидного экстракта среды бактерий R.erythropolys X5,выращенных на н-гексадекане при 26оС.
Масс-спектр этого соединения [7]был аналогичен масс-спектру, полученному нами. На основе сравнения слитературнымиданнымибылосделанопредположение,чтоэтоткомпонент представляет собой смесь гомологов тетраэфира трегалозы,содержащих остатки янтарной, октановой и декановой кислот.Анализ MC/MC спектров позволил нам рассмотреть структурусоединений более подробно. В MC/MC спектре натриевого аддукта[M+Na]+ с m/z 899 наблюдаются пики c m/z 799, m/z 781, m/z 755, m/z 727,которые соответствуют соединениям, образовавшимся путем отщепленияфрагментов ангидрида янтарной кислоты (-100Да), янтарной (-118Да),октановой (-144Да) и декановой кислот (-172Да), соответственно (рис. 31).Ион с m/z 583 соответствует соединению, образованному после разрыва98гликозидной связи в трегалолипиде, в результате чего отщепляетсяфрагмент ангидрида глюкозы, ацилированной декановой кислотой (-316Да).
Это предполагает наличие у одного глюкопиранозного кольцаединственного остатка декановой кислоты, а у второго - по одному остаткуянтарной, октановой и декановой кислоты.Рисунок 31. Фрагментация в положении иона [M+Na]+ с m/z 899 (а –исходные масс-спектры, б – с формулами)В результате фрагментации иона [M+Na]+ с m/z 871 в спектре99МС/МС появились пики с m/z 771, m/z 753, m/z 727, m/z 699 (рис. 32),которые образовались путем отщепления тех же фрагментов, что и прираспаде молекулярного иона с m/z 899.
Однако вместо пика с m/z 583появился пик с m/z 555, который соответствует глюкопиранозе,ацилированнойянтарнойидвумяоктановымикислотами.Этоподтверждает предположение о том, что оба трегалолипида являютсягомологами.Рисунок 32. Фрагментация в положении иона [M+Na]+ с m/z 871 (а –исходные данные, б – схема фрагментации)100В работе [63] описано, что при культивировании на н-гексадеканебактерии R.
wratislaviensis при 28 С продуцировали два тетраэфиратрегалозы, которые на хроматограмме проявлялись в виде одной полосы сRf 0,39 в системе дихлорметан – метанол – вода (2.6:0.6:0.02). Массспектрометрия с ионизацией электрораспылением в положительномрежиме показала наличие двух соединений, которым соответствовалиионы [M+Na]+ с m/z 899 и 871. Как видно, эти значения m/z совпадают сполученными нами значениями. Фрагментация этих пиков, приведѐнная вработе [64], аналогична фрагментации наших соединений. Использованиев той же работе ЯМР-анализа позволило более точно установитьраспределение остатков карбоновых кислот в молекулах гликолипида.
Утрегалолипида массой 876Да одно глюкопиранозное кольцо ацилированоостатком декановой кислоты в положении С-2', а другое - остаткомянтарной в положении С-2 или С-4, остатком декановой и остаткомоктановой кислот в положения С-2, С-3 или С-4. Трегалолипид массой 848Да отличался тем, что положения С-2, С-3 или С-4 были ацилированыдвумяостаткамиоктановойкислоты.Соединениясаналогичнойструктурой были обнаружены при анализе гликолипидов, продуцируемыхштаммом Rhodococcus sp. MS11 при росте на гексадекане при 20 С. Дляэтих соединений была продемонстрирована идентичная фрагментацияионов [M+Na]+ сm/z 899 и 871, а ЯМР-анализ подтвердил наличиезаместителей в положениях С-2, С-3, С-4 и С-2' [23].
Сравниваяполученные нами результаты и результаты предшествующих работ, можнозаключить,чтоосновнымибиосурфактантами,продуцируемымиштаммами X5 и S67 выращенных на н-гексадекане как при 26оС, так и при10оС являются 2,3,4-сукцинил-октаноил-деканоил-2'-деканолитрегалозой и2,3,4-сукцинил-диоктаноил-2'-деканолитрегалозой.Дваостальныхсигналысm/z843,927обладаютнизкойинтенсивностью, и их фрагментацию не проводили. Однако, по аналогии с101предыдущим анализом можно заключить, что ионы [M+Na]+ с m/z 843 иm/z 927 соответствуют тетраэфиру трегалозы с тремя остатками октановойкислоты – 2,3,4-сукцинил-диоктаноил-2'-октаноилтрегалозе и с тремяостаткамидекановойкислоты–2,3,4-сукцинил-дидеканоил-2'-деканоилитрегалозе.В МС/МС спектре депротонированного иона [M-Н]- с m/z 875наблюдаются пики c m/z 775, m/z 631, m/z 603 (рис.
33), а в МС/МС спектреиона [M - Н]- с m/z 847 – пики с m/z 747, m/z 603, m/z 575 (рис. 34), которыесоответствуют соединениям, образовавшимся путем отщепления тех жефрагментов, как в условиях регистрации положительных ионов.Рисунок 33. Фрагментация в положении иона [M-H]- с m/z 875102Рисунок 34.
Фрагментация в положении иона [M-H]- с m/z 847Этоподтверждаетнашепредположениеотом,чтообатрегалолипида являются гомологами: 2,3,4 сукцинил-диоктаноил-2’октаноилтрегалозаи2,3,4-сукцинил-октаноил-деканоил-2’-октаноилтрегалозаДляподтвержденияпредложеннойструктурысукцинилтрегалолипидов проводили анализ жирнокислотного состававыделенного соединения после метанолиза исследуемых трегалолипидов.В результате ГХ/МС анализа метиловых эфирных жирных кислотвыявлено, что единственными жирными кислотами являются октановая идекановая кислоты. Таким образом, гликолипидный компонент схроматографической подвижностью Rf 0,35 представляет собой гомологитетраэфира трегалозы, содержащие один остаток янтарной кислоты и триостатка жирных кислот (октановой и декановой) (табл. 18).Таблица 18. Жирнокислотный состав сукцинилтрегалолипидов,продуцируемых бактериями R.erythropolis X5 и R.erythropolis S67[M+Na]+МR2R2’R3R4843820C4C8C8C8871848C4C8C8C10899876C4C10C8C10927904C4C10C10C10103Таким образом, нами впервые показано, что качественный составвыделяемых Rhodococcus биосурфактантов при росте на н-гексадекане вусловияхпониженнойтемпературы10°С,соответствуетсоставубиосурфактантов, продуцируемых родококками при 26°С.
Это означает,что важную роль в потреблении гидрофобных субстратов бактерияминефтедеструкторами играют гликолипидные биосурфактанты независимоот агрегатного состояния субстрата. Биосурфактанты способствуютдоступности н-гексадекана¸ находящегося как в жидком, так и в твердомсостоянии,дляутилизацииповерхностно-активнымимикроорганизмами.иЭтообусловленоэмульгирующимисвойствамисукцинилтрегалолипидов.3.7.
Характеристика сукцинилтрегалолипидов как сурфактантовОсновныефизико-химическиесвойствавыделеннойсмесигомологов сукцинилтрегалолипидов определяли на основе их способностиснижать поверхностное натяжение водного раствора и ресуспендироватьдве несмешивающиеся жидкости. Анализ зависимости поверхностногонатяжения раствора от концентрации трегалолипидов показал, что приувеличении концентрации вещества происходит снижение поверхностногонатяжения водного раствора, что характерно для поверхностно-активныхвеществ.3.7.1 Критическая концентрация мицеллообразованияКритическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) смесисукцинилтрегалолипидов определяли по точке перегиба графическойзависимости поверхностного натяжения от концентрации биосурфактанта.При этом считали, что основным компонентом в смеси является 2,3,4сукцинил-октаноил-деканоил-2’-деканоилтрегалозаЗначениеККМсоставило4.1×10–5Мповерхностном натяжении 27мН/м (рис.
35).104(32мг/л)(М=876г/моль).припостоянномРисунок 35. Зависимость поверхностного натяжения от концентрациитрегалолипидов в водном растворе.Полученные нами результаты соответствуютданным другихавторов, изучавших свойства трегалолипидов (табл.19). Так, в работе [71]продемонстрировано, что трегалолипиды, продуцируемые бактериямирода Rhodococcus, способны снижать поверхностное натяжение водныхраствор с 72мН/м до значений в интервале 19 – 43мН/м, а ККМтрегалолипидов находится в интервале 0,7 – 37мг/л.Таблица19.Физико-химическиесвойстватрегалолипидов,продуцируемых бактериями рода RhodococcusБактериипродуцентыБиосурфактантыдикориномиколаты трегалозымонокориномиколаты трегалозы2-2’,3,4тетраэфирытрегалозыR.erythropolis тетраэфирыDSM 51T7трегалозыR.ruberгликолипидыR.erythropolisDSM 43215R.erythropolisDSM 43215R.erythropolisDSM 43215Поверхностноенатяжение(мН/м)36Межфаз ККМное(мг/л)натяжение(мН/м)174Источник[101]32144[101]26<115[101]27,9537[25]26,80.954[98]105IEGM235R.wratislavientisBN38Rhodococcussp.
H13ARhodococcussp. SD-74R.ruber 725R.erythropolisATCC4277Rhodococcussp. PML026R opacus 1CPсукцинилтетраэфирытрегалозыоктаацилтрегалозы24,41.35[63]Не опр.0.021.5[60]19Не опр.5,6x 10-6M[26]29,5Не опр.Не опр.[66]38Не опр.Не опр.[105]29Не опр.250[27]Не опр.Не опр.[56]сукцинилтрегалолипидыорганическийэкстракторганическийэкстракттрегалолипидыдимиколатытрегалозыИндекс эмульгирования (E24) сукцинилтрегалолипидов, которыйопределяли в системе с н-гексадеканом, составил 55%. Ившина соавторами [59] определяли E24 биосурфактантов, продуцированныхбактериями R. erythropolis, R. longus, R. opacus и R. ruber, и получилимаксимальное значение 62,5%. Тетраэфиры трегалозы бактерий R.wratislaviensis в зависимости от гидрофобных веществ, смешиваемых сводой,проявлялиE24от23%до69%[63].Такимобразом,сукцинилтрегалолипиды, продуцируемые бактериями штаммов X5 и S67,обладают высокой поверхностной и эмульгирующей активностью, чтохарактерно для бактерий рода Rhodococcus.Активность биосурфактантов можно охарактеризовать физикохимическими показателями – минимальным значением поверхностногонатяжения на границе раздела «жидкость – воздух» (σмин), максимальнымколичеством молекул, адсорбируемых на единице площади раздела фаз(Г),минимальнойплощадью,занимаемойодноймолекулойбиосурфактанта (Sмин) и свободной энергией мицеллообразования (∆G).Основные физико-химические характеристики сукцинилтрегалолипидногобиосурфактанта были определены (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
