Диссертация (1091621), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Морфология R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при ростена гексадеканеПри выращивании родококков на гексадекане в жидкой среденаблюдали формирование биомассы бактерий R. erythropolis X5 иR. erythropolis S67 разной морфологии (рис. 23).Рисунок 23. Микрофотографии родококков, выращенных на гексадекане втечение 6 суток в жидкой среде при 10оС: а – R. erythropolis X5; б - R. erythropolis S67.Длина масштабной метки 10µм88Бактерии X5 локализованы на границе раздела фаз гексадекан-вода,в то время как клетки S67 располагаются в центре гидрофобной капли.Кроме того, температура среды в значительной степени влияет наморфологию бактерий S67: клетки приобретают вытянутую форму иобразуют цепочки. Гидрофобность клеточной стенки R.
erythropolis S67выше, чем у R. erythropolis X5 (п.3.3). Возможно, это и определяетфизиологическое поведение бактерий в культуральной среде (п.3.2.1).3.5.2. Ультраструктурная организация клеток R. erythropolis X5 иR. erythropolis S67 при росте на гексадеканеПри температуре роста 26оС через 6 суток культивированияобнаруживается в культуральной среде много лизированных клетокбактерий обоих штаммов. На рисунке 8 приведены микрофотографиибактерий R. erythropolis S67, на которых видны лизированные клетки (рис.24).Рисунок 24. Ультратонкие срезы клеток R.
erythropolis S67(условия культивирования бактерий: 2% гексадекан; 26оС; 6суток).Виднывнутрицитоплазматическиемембранныеструктуры различной морфологии. КС - клеточная стенка;ММСмультимембранныеструктуры;ЦМцитоплазматическая мембрана; В – липидные включения; ВПСвнеклеточные полимерные соединения. Длина масштабнойметки - 0.2 мкм.89В клетках бактерий наблюдаются крупные включения (В), какправило, единичные, часто полигональной формы с резко очерченнымиострыми углами и контурами. Мультимембранные структуры (ММС)слабо развиты внутри цитоплазмы и четко видны только в областиограничительного контура включений.Клетки бактерий, выращенных на н-гексадекане в течение 6 сутокпри 10оС, значительно отличаются по ультратонкой организации отклеток, выращенных при 26оС. На фотографиях ультратонких срезовклеток цитоплазматическая мембрана (ЦМ) бактерий Rhodococcus имеетэлектронно-прозрачный слой, снаружи к ЦМ прилегает клеточная стенка(КС), типичная по ультраструктуре для грамположительных бактерий (рис.25).
Чаще всего она имеет вид плотного гомогенного слоя толщиной 2030 нм. Наружная поверхность клеточной стенки покрыта тонкиммикрофибриллярнымвнеклеточнымислоемиразличнымиультраструктурамисповерхностнымихарактернойигранулярно-фибриллярной или везикулярной организацией (ВПС), которые имеютвысокое сродство к рутению красному.
В цитоплазме встречаютсяэлектронно-прозрачныевключения(В),характерныедлявеществгидрофобной природы (рис. 25в, 25б). Включения сферической формы,мелкие или среднего размера. Число включений на срез клетки колеблетсяот 0 – 1 до 3 – 4. Мы предполагаем, что включения представляют собойтриацилглицериды в окружении полярных липидов. Это подтверждаетсяданными о низком содержании н-гексадекана и высоком содержаниижирных кислот в составе клеточных липидов (п.3.4). На ультратонкихсрезахобнаруживаютсямультимембранныеструктуры(ММС)преимущественно в виде множественных, уложенных параллельно другдругу мембраноподобных петлевидных или трубчатых образований, какправило, связанные с гидрофобными включениями (рис. 25б, 25г).Профиль ММС состоит из нескольких электронно-плотных слоев (аналог90гидрофильныхслоевбиологическихэлектронно-прозрачнымислоямимембран),(аналогчередующихсягидрофобныхсзонбиологических мембран) (рис.
25). Подобные структуры ранее былиобнаружены у Sulfobacillus при окислении гидрофобной серы [170], уPseudomonas, способных утилизировать додецилсульфат натрия [171],[172] и у Acinetobacter sp., выращенных на углеводородах [173].Предположительно,ММСучаствуютвтранспортегидрофобногосубстрата в клетку. Мы предполагаем, что ММС также могут участвовать вчастичном окислении гексадекана до гексадекановой кислоты поддействием мембранолокализованных ферментов. Об этом косвенносвидетельствует наличие гексадекановой кислоты в культуральной средебактерий (п.3.4.3).Рисунок 25.
Ультратонкие срезы клеток (условия культивирования бактерий:2% гексадекан; 10оС; 6 суток): а, б - R. erythropolis S67; в, г - R. erythropolis X5.Видны внутрицитоплазматические мембраноподобные структуры различнойупаковки. КС - клеточная стенка; ММС - мультимембранные структуры; ЦМ цитоплазматическая мембрана; В – липидные включения; ВПС- внеклеточныеповерхностные структуры. Длина масштабной метки - 0.2 мкм.91Вблизиповерхностинепосредственнонаповерхностивыявляютсямножественныесферическойформысиклетокгранулыгомогеннымсодержимым, иногда имеющие сходство свезикулами, т.е. окруженные трехслойноймембраной (рис.
26). Наружная поверхностьэтих образований покрыта тонким рыхлымслоем с высокой электронной плотностью.Этивезикулярныепредставлятьсобойобразованиядепомогутгидрофобногосубстрата – гексадекана, в виде крупныхмицеллярных структур. На ультратонкихсрезахобнаруженыэлектронно-плотныенити (фибры, Ф), которые окружают исоединяют везикулы с поверхностью клетки.Подобные структуры наблюдали Уайт ссоавт.приизучениифизиологическойадаптации родококков, способных расти нагексадекане при 5оС [110]. Мы предполагаем,что внеклеточные биосурфактанты образуютгидрофобныеканалы,связывающиелипидные везикулы с клеточной стенкойРисунок 26.
Ультратонкие срезыкультуральной среды с клеткамиR. erythropolisS67(условиякультивирования бактерий: 2%огексадекан; 10 С; 6 суток): Виднывезикулы(ВЗ),окруженныеоболочкой из электронно-плотныхслоев, связанные с клеткамибактерий с помощью электронноплотных фибрилл (Ф). Длинамасштабной метки - 0.1 мкмбактерий и способствующие поступлениюгексадеканаилиегопромежуточныхметаболитов,например,гексадекановой кислоты, в клетки бактерий. Следует отметить, чтоотрицательно заряженные сукцинилтрегалолипиды, в состав которыхвходит остаток янтарной кислоты, могут проявлять высокое сродство кположительно заряженному рутениевому красному, что, возможно, и92приводит к появлению электронно-плотных структур в области ихлокализации.Этобиосурфактантоввобъясняетметаболизмерольсукцинилтрегалолипидныхн-гексадеканаприпониженнойтемпературе.3.6 Выделение и характеристика гликолипидных биосурфактантов3.6.1 Обнаружение гликолипидов в культуральной среде бактерийДля выявления гликолипидных биосурфактантов, продуцируемыхисследуемыми бактериями при росте на н-гексадекане, липидный экстрактиз бесклеточного супернатанта анализировали методом тонкослойнойхроматографиисα-нафтольнымреагентом.Хроматограммыдвухобразцов, выделенных из среды культивирования штамма X5 при 10оС и26оС, имеют пять одинаковых сигналов гликолипидных компонентов с Rf0,35, 0,42, 0,45, 0,54, 0,64 (рис.
27а). Липидные экстракты, выделенные изсреды штамма S67, содержат такие же компоненты с Rf 0,35, 0,42, 0,45,0,54. При пониженной температуре, по сравнению с 26 оС, бактерии S67продуцируют в среду также и более подвижные гликолипидныекомпоненты с Rf 0,64 и 0,76.93Рисунок 27. Хроматограмма липидных экстрактов, выделенных бактериямиштаммов X5 (а) и S67 (б) при росте на н-гексадекане в условиях температуры 26оС и10оСАнализ интенсивности проявления гликолипидных компонентов нахроматограммах позволяет заключить, что при пониженной температурекультивированиявлипидныхэкстрактахбактерийуменьшаетсяотносительное содержание гликолипида с Rf 0,35, при этом содержаниеболее подвижных компонентов увеличивается.3.6.2.
Выделение и очистка гликолипидных биосурфактантовОбщая схема выделения и очистки внеклеточных гликолипидовпредставлена на схеме (рис. 28).94Рисунок 28. Общая схема выделения и очистки трегалолипидныхбиосурфактантовДля выделения биосурфактантов из культуральной среды биомассубактерий отделяли центрифугированием, липиды экстрагировали изсупернатанта полярными органическими растворителями (хлороформ:метанол). После упаривания растворителя липиды очищали от нгексадеканагексаномспомощьюфлэш-хроматографии.Послеэлюирования полярных липидов с сорбента смесью хлороформ – метанол(2:1) и упаривания растворителя получали смесь внеклеточных липидов,которые могут представлять собой биосурфактанты. Продуктивностьсинтеза биосурфактантов экзотипа бактериями определяли по массеполученных из бесклеточной среды липидов (таблица 17).95Таблица 17.
Выход биосурфактантов, продуцируемых бактериямиRhodococcus при 26оС и 10оС в культуральную средуМикроорганизмыпродуцентыШтамм X5Штамм S67Продуктивность, г/л26oC10oC1.30.30.30.15При пониженной температуре способность бактерий продуцироватьвнеклеточные биосурфактанты снижается. Эти данные коррелируют сфизико-химическимпоказателембесклеточнойсредыбактерий(поверхностное натяжение среды и содержание сахаров) (п.3.2). Важноотметить,чтоerythropolisбактерииR.продуцируютX5биосурфактантынамногоэффективнее, чем бактерии R.erythropolis(табл.17).S67Вероятно, это объясняет разноефизиологическоеповедениебактерий штаммов X5 и S67 приростенан-гексадекане.бактерийR.РостerythropolisX5наблюдается в виде планктоннойкультуры, в то время как бактерииR.erythropolisпленкусS67образуютгексадеканомповерхностижидкойнасреды(п.3.2).
Таким образом, бактерииодноговидаобусловленное,проявляютвтомРисунок29.Хроматограммыорганических липидов бактерий X5 иS67 при температуре роста 26оС (1, 3),и при 10оС (2, 4), соответственно; (5) –хроматограммаосновногогликолипида с Rf 0,35разноечисле,ихфизиологическоеспособностьювнеклеточные биосурфактанты с разной эффективностью.96поведение,продуцироватьОчистку основного компонента гликолипидов (Rf 0,35) проводилиметодом колоночной хроматографии на силикагеле по схеме (рис. 28).
Дляэтого использовали хлороформ и хлороформ – метанол с увеличениемградиента метанола в системе для поэтапной очистки целевого продукта отменее полярных примесей. Гликолипиды разделяли с помощью системхлороформ – метанол (10:3 и 10:4). Полученный гликолипидныйкомпонент (рис. 29, образец 5) использовали для определения химическойструктуры и физико-химических свойств.3.5.2 Определение структуры трегалолипидовГликолипидные компоненты с одинаковой хроматоргафическойподвижностью (Rf 0,35), выделенные из среды бактерий X5 и S67,анализировали методом масс-спектрометрии. В масс-спектрах этихкомпонентов из среды бактерий обоих штаммов, выращенных при 10 С, вусловиях регистрации положительных ионов присутствуют те же сигналы,что и для образцов, полученных при 26 С: три сигнала натриевых аддуктов[M+Na]+ с m/z 871, m/z 899 и m/z 927, которые соответствуютмолекулярным массам 848, 876 и 904Да (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
