Диссертация (1091621), страница 11
Текст из файла (страница 11)
erythropolis X5 и R. erythropolis S67 выращивали нагидрофобных(глюкоза)(дизельноесубстратахитопливо,н-гексадекан)определялиигидрофильномсравнительнуюспособностьмикроорганизмов продуцировать биосурфактанты. Для этого использовалискрининговыйметод,основанныйнаопределениисурфактантнойактивности культуральной среды (поверхностной и эмульгирующейактивности бесклеточного супернатанта) через 6 суток роста биомассы при26оС и через 12 суток при 10оС. Поверхностную активность определяли,как способность продуцируемых биосурфактантов снижать поверхностноенатяжение культуральной среды на границе с воздухом (табл.
9, 10). Методопределения эмульгирующей активности основан на измерении высотыобразующейся эмульсии при добавлении бесклеточной среды, содержащейбиосурфактанты, к двухфазной системе н-гексадекан – вода [165].Полученные результаты представлены в таблицах 9, 10.Таблица 9. Показатели сурфактантной активности бесклеточной средыбактерий R. erythropolis X5 при росте на разных субстратахФизикохимическиепоказателиИндексэмульгированияE24, %Поверхностноенатяжение, мН/мПосле 6 сутоккультивирования при 26оСПосле 12 сутоккультивирования при 10оСнгексадекан глюкозаглюкозаДТ0205455402767ДТнгексадекан0436635532Таблица 10. Показатели сурфактантной активности бесклеточной средыбактерий R.
erythropolis S67 при росте на разных субстратахПосле 6 сутоккультивирования при 26оСнглюкоза ДТ гексадеканФизикохимическиепоказателиИндексэмульгированияE24, %Поверхностноенатяжение, мН/мПосле 12 сутоккультивирования при 10оСнглюкоза ДТ гексадекан01836038584527645842При росте на глюкозе происходит незначительное снижениеповерхностного натяжения среды пи полном отсутствии эмульгирующейактивности независимо от температуры культивирования обоих штаммовбактерий.
В присутствии дизельного топлива как источника углероданаблюдаетсяболееэффективноеобразованиевнеклеточныхбиосурфактантов, что приводит к снижению поверхностного натяжениясреды с 72 мН/м до 40 – 45мН/м при температуре культивированиямикроорганизмов26оСи55–58мН/м–при10оС.Наилучшуюсурфактантную активность бесклеточной среды наблюдали при ростебактерийнан-гексадекане,причембактерииR.erythropolysX5продуцировали биосурфактанты более эффективно, в том числе припониженной температуре.
Для дальнейших исследований использовали нгексадекан в качестве модельного субстрата для изучения способностибактерий продуцировать гликолипидные биосурфактанты при росте нагидрофобных субстратах в условиях пониженных температур длядальнейшейразработкибиотехнологийочисткинефтезагрязненныхтерриторий в холодном климате.3.2.Влияниетемпературынапродуцировать биосурфактанты68способностьродококковДля выяснения взаимосвязи между образованием биосурфактантов ифазамиростабактерийопределялиповерхностноенатяжениеисодержание сахаров в бесклеточной среде каждые 24 часа.
В ходекультивирования родококков на н-гексадекане при 26оС наблюдалипоявление молочной эмульсии в среде бактерий R. erythropolis X5, этаэмульсияраспределяласьравномерно по всему объемусреды,иеемутностьувеличиваласьпридальнейшем культивированиив течении 6 суток, т.е. бактериирастут в виде планктоннойкультуры (рисунок 15а). В товремякак,наповерхностикультуральной среды бактерийR.erythropolisформироваласьS67пленкаужечерез 24 часа (рисунок 15в),Рисунок 15.
Физиологическое поведениеродококков при росте на н-гексадекане: а, в культуральная среда бактерий X5 и S67 при26оС; б, г - культуральная среда бактерий X5и S67 при 10оС.суспензия в объеме среды была менее плотная, чем у R. erythropolis X5.Следует отметить, что у родококков S67 наблюдается уменьшение рНкультуральной среды от 7 до 4 (в конце эксперимента), что не характернодля бактерий X5.
Подобный эффект изменения рН в процессебиодеградации гексадекана бактериями R. erythropolis NTU-1 наблюдалидругие исследователи [165]. Они предположили, что образованиебиопленки и микроколоний может защищать клетки от экстремальныхусловий среды, таких как низкое значение рН.На рисунке 16 представлена зависимость между динамикой ростабактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 на н-гексадекане и физикохимическими показателями среды. Численность бактерий в жидкой среде69определяли турбидиметрическим методом по изменению мутности среды впроцессе роста биомассы. Бактерии X5 адаптировались и переходили вэкспоненциальнуюстадиюростачерезсуткикультивирования,интенсивный рост продолжался в течение 3-х суток, максимальноезначение оптической плотности бактериальной суспензии составило 3,0(рисунок 16а, кривая.1).
В то же время в культуральной среде бактерийS67наблюдалосьпостепенноеувеличениеоптическойплотности,максимальное значение достигалось на 5-е сутки и составило 0,5 (рисунок16в, кривая 1). Следует отметить, что при этом не удается учитыватьбактерии, образовавшие слой на поверхности культуральной среды, что иобъясняет такой разный результат для двух штаммов и соответствуетфизиологическому поведению бактерий: образование молочной суспензииу R.
erythropolis X5 и формирование биопленки на поверхности у R.erythropolis S67.Рисунок 16. Динамика роста (1), изменение содержания трегалолипидов иповерхностного натяжения (3) культуральной среды бактерий штаммов X5 и S67 приросте на н-гексадекане при 26оС (а, в) и 10оС (б, г)Активностьродококкамивисодержаниекультуральнуюбиосурфактантов,среду70оценивалипродуцируемыхпоизменениюповерхностного натяжения и увеличению количества сахаров на разныхстадиях роста микроорганизмов. В ходе культивирования бактерий нагексадекане при 26оС наблюдали резкое уменьшение поверхностногонатяжениябесклеточногосупернатантадо27мН/мвконцеэкспоненциальной фазы – начале стационарной фазы роста для обоихштаммов родококков (рисунок 16а, в - кривая 3). Это значение сохранялосьна протяжении всего времени роста микроорганизмов, несмотря наразличие в физиологическом поведении (рисунок 16а, в - кривая 1).
Вместесо снижением поверхностного натяжения увеличивалось содержаниегликолипидов в бесклеточной среде. После 6 суток культивированияродококков содержание гликолипидов составило около 300 мг/л для обоихштаммов (рисунок 16а, в кривая 2). При определенном содержаниигликолипидов в среде (около 120мг/л) поверхностное натяжение перестаетснижаться,вероятно,из-задостижениякритическойконстантымицеллообразования (ККМ). Следует отметить, что такое же содержаниетрегалолипидов(300мг/л)вбесклеточномсупернатантеприповерхностном натяжении 29мН/м было получено Вайтом в ходекультивирования Rhodococcus sp.
PLM026 на подсолнечном масле при19оС [27]. Полученные нами результаты согласуются с данными другихавторов по поверхностной активности культуральной среды бактерийродококков при росте на гидрофобных субстратах (таблица 11).Таблица 11. Значение поверхностного натяжения среды прикультивировании бактерий рода Rhodococcus в жидкой минеральной средеМикроорганизмы ОбразецRhodococcussp.51T7R. erythropolisбесклеточнаякультуракультуральная среда“R. longus”культуральная средаR.
opacusкультуральная средаПоверхностное Субстратнатяжение,мН/м30-35н-алкан(С12-С16)27,1нгексадекан27,2нгексадекан26,5нгексадекан71Источники[25][24]R. ruberкультуральная среда27,4R.erythropolisEK-1R.erythropolis3C-9R.wratislaviensisBN38Rhodococcus sp.MS11R. ruber Z25бесклеточнаякультуракультуральная среда30-39культуральная среда28,6культуральная среда< 29липидный экстракт29,5RhodococcusS26sp. бесклеточнаякультура33,432нгексадеканнгексадеканнгексадеканнгексадеканн-алканнгексадеканнгексадекан[103][65][63][23][66][7]В ходе культивировании родококков при 10оС, когда н-гексадеканнаходится в твердом агрегатном состоянии, наблюдали постепенноеобразование суспензии по всему объему среды и тонкую пленку награнице с твердым гексадеканом (рисунок 15б, 1г).
Значения оптическойплотности культуральной среды бактерий X5 больше, чем у бактерий S67,как и при 26оС. Вместе с ростом бактерий на гексадекане увеличиваетсясодержание сахаров в культуральной среде, максимальное значениекоторого достигало 100 мг/л для обоих штаммов после 6 суток. При этомповерхностное натяжение постепенно снижается до минимальногозначения только на 12 сутки: 32мН/м и 45мН/м для штаммов X5 и S67,соответственно (рисунок 16б, г-кривая 1).
Это свидетельствует оспособности бактерийR. erythropolis продуцировать внеклеточныебиосурфактанты даже при пониженной температуре. В работе [4]продемонстрировано, что арктические бактерии Rhodococcus при росте натетрадекане при 15оС продуцируют биосурфактанты, которые способныснижать поверхностное натяжение культуральной среды в интервале от 66до 27мН/м.
Другие авторы показали, что поверхностное натяжение средыпри росте на керосине морских бактерий Rhodococcus sp. LF13 и LF22 вусловиях пониженной температуры (13оС) снижалось до 37 и 30мН/м,соответственно [3]. Поверхностное натяжение культуральной среды72бактерий Rhodococcus sp. Q15, выращенных на дизельном топливе при 5оС,снизилось до 40мН/м [110]. Таким образом, результаты, полученные нами,согласуются с данными других авторов о способности бактерий родаRhodococcusпродуцироватьбиосурфактантыприпониженныхтемпературах.Кроме поверхностной активности одним из главных физикохимических показателей культуральной среды является эмульгирующаяактивность, которую определяют по индексу эмульгирования через 1 час(Е1) или через 24 часа (E24). При температуре культивирования 26оС E24бесклеточной среды бактерий штамма X5 к гексадекану составил 55%, адля штамма S67–36% (табл. 12).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
