Диссертация (1091621), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Только некоторые из них являются коммерческидоступными, поэтому растет интерес к разработке биотехнологийполучения других биосурфактантов. Актиномицеты, к которым относятсябактерии рода Rhodococcus, являются эффективными продуцентамитрегалолипидов, которые выполняют различные функции, в том числеявляютсябиосурфактантамигидрофобныхсубстратов.иобеспечиваютРодококкиспособныбиодоступностьадаптироватьсякэкстремальным условиям окружающей среды, в том числе к пониженнымтемпературам. Они используют гидрофобные соединения в качествесубстратов. Сукцинилтрегалолипиды, продуцируемые родококками при18-30оС,температурахэмульгирующейобладаютактивностью,чтовысокойповерхностнойопределяетихроль,икакбиосурфактантов, в процессе биодеградации гидрофобных субстратов.Однако нам не удалось найти никакой информации о природебиосурфактантов, продуцируемых бактериями рода Rhodococcus припониженной температуре.
Таким образом, Определение структуры исвойств биосурфактантов, продуцируемых родококками при пониженнойтемпературе, и обоснование потенциала применения биосурфактантов дляутилизации углеводородов является актуальной задачей.Длявыявленияспособностибактерийпродуцироватьбиосурфактанты существуют различные скрининговые методы. Наиболее52простым в исполнении и достоверным является метод определенияповерхностногонатяжениянаграницераздела«вода-воздух».Гликолипиды можно обнаружить качественными реакциями с фенолами.Для выделения и очистки используют метод экстракции полярнымирастворителями и адсорбционную хроматографию на силикагеле. Длявыделенияиндивидуальныхвысокоэффективнойкомпонентовхроматографии.используютХимическуюметодыструктуругликолипидов определяют с помощью комплекса методов, таких как массспектрометрия,жирнокислотныйанализ.использованы в работе.53Всеэтиметодыбыли2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты исследования и условия культивированияМикроорганизмы и условия культивированияШтаммы Rhodococcus erythropolis X5 и Rhodococcus erythropolis S67выбраны из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН.Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г.Пущино)подномерамиВКМАс-2532ДиВКМАс-2532Д,соответственно. Бактерии входят в состав биопрепарата «МикроБак»,который используют для биоремедиации нефтезагрязненных территорий[156]Питательные среды и условие культивированияМикроорганизмы культивировали в жидкой минеральной средеЭванса [158] и полноценной среде Лурия-Бертани [158], состав которыхприведен в таблице (6).Таблица 6.
Состав питательных средСостав питательной среды Лурия-Бертани (на 1 литр воды)П/пКомпонентыСостав, г1Тритон102Дрожжевый экстракт53Натриевый хлорид (NaCl)10Состав минимальной минеральной среды Эванса (на 1 литр воды)П/пКомпонентыСоставK2HPO418,71г5М раствор NH4Cl21 мл0,1М раствор Na2SO431 мл62мМ раствор MgCl241 мл1мМ раствор CaCl251 мл0,005мМ раствор (NH4)6Mo7O2461 мл7Микроэлементы (состав в 1% растворе HCl, 1 млг/л: ZnO - 0,41; FeCl2 -2,9; MnCl2 - 1,28; CuCl2 0,13; CoCl2 - 0,26; H3BO17 - 0,06)54Готовые среды титровали соляной кислотой до рН 7.0.
Готовуюсреду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 116°С и давлении0,5 атм. В среду добавляли субстрат (н-гексадекан, дизельное топливо,глюкоза; 2%, по объему) в качестве единственного источника углерода иэнергии.Бактерии выращивали в жидкой питательной среде ЛБ в течение 24часов для получения инокулята. Культивирование микроорганизмовпроводили в колбах Эрленмейера объѐмом 750мл при 26 оС и 10оС наорбитальной (180об/мин) качалке Excella 25 (Eppendorf, Германия).2.2 Рост микроорганизмов и продуцирование биосурфактантовРост микроорганизмов определяли по изменению оптическойплотности (ОП600нм).Поверхностное натяжение бесклеточного супернатанта измеряли натензиометре Kruss K6 (Kruss, Германия) методом отрыва кольца Дю Нуипри температуре 25°С [7].Содержание биосурфактанта оценивали по концентрации сахаров вкультуральной среде бактерий. Для этого определяли их содержаниеколориметрическимметодомпослевзаимодействиясфенольнымреактивом [153].
Бесклеточную среду (супернатант) супернатант получалицентрифугированием культуральной среды на центрифуге TG16WS(Поликом, Россия) при 10 000g в течение 10мин при 4оС. Супернатанта(500мкл) помещали в пробирку, добавляли 500мкл 5% раствора фенола вводе. При интенсивном перемешивании вносили 2,5мл концентрированнойсерной кислоты (р=1,84г/мл), оставляли на 10мин. Измерение оптическойплотности полученного раствора проводили при длине волны 480нм нафотометре Эксперт - 003 (Эконикс-Эксперт, Россия).
Раствор сравненияготовили аналогично, заменяя пробу дистиллированной водой.Индексэмульгированиябесклеточнойсредыопределялипометодике [134]. В мерную пробирку к 4,0мл супернатанта добавляли 4,0мл55гидрофобного субстрата (н-гексадекана). Полученную смесь интенсивноперемешивали в течение двух минут и оставляли на 1 и 24 часа прикомнатной температуре. Индекс эмульгирования определяли через 1 (Е1) и24 часа (Е24) и рассчитывали по формуле:=× 1000Где: E – индекс эмульгирования (%), H(e) – высота слоя образуемойэмульсии, H (0) – высота полного слоя жидкости.2.3 Гидрофобность клеточной поверхности микроорганизмовГидрофобность определяли по МATH-тесту (Microbial Adherence toHydrocarbon) [159] с модификациями [160] . Культуральную жидкостьцентрифугировали в течение 10мин., при 10000g на центрифуге TG16WS(Поликом,Россия).Клеточнуюбиомассудваждыотмываливдистиллированной воде и ресуспендировали в фосфатно-магниевом буфере(г/л) – 22,2g K2HPO4.3H2O; 7,26g KH2PO4; 1,8g мочевина; 0,2g MgSO4.7H2O(рН=7,0).
При этом значение оптической плотности (ОП600нм) клеточнойсуспензии всех образцов должна быть в пределе 0,48 – 0,50. К 3,0млклеточной суспензии добавляется 0,5мл н-гексадекана. Содержимоепробирок интенсивно встряхивали в течение 3 минуты на шейкере при2000об/мин. После отстаивания в течение 10мин при комнатнойтемпературе происходило разделение водной и углеводородной фазы.Пробу аккуратно отделяли от водной фазы и измеряли оптическуюплотность водной фазы при 600нм. Степень адгезии клеток рассчитывалипо формуле: % = 1−0× 10056где: Н(%) – гидрофобность клеточной поверхности (%);A0, A –оптическая плотность клеточной суспензии до и после добавления нгексадекана, соответственно.2.4 Трансмиссивная электронная микроскопияКлетки бактерий фиксировали в 1,5%-ном растворе глутаровогоальдегида в 0,05 М какодилатном буфере (рН 7,2) при 4°С в течение 1ч,трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1%ном растворе OsO4 в 0,05М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 3ч при20°С.
После обезвоживания материал заключали в эпоксидную смолуEpon-812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки иконтрастировали в течение 30мин в 3%-ном растворе уранилацетата в70%-ном спирте и дополнительно окрашивали цитратом свинца поРейнольдсу [161].2.5 Содержание общих липидов клеток бактерийСуммарныеклеточныелипидыэкстрагировалиполярнымиорганическими растворителями из влажной биомассы бактерий пометодике [162] с модификацией после удаления избытка н-гексадеканагексаном.
Влажную биомассу, содержащую 40 – 50 мг клеток (в расчете насухой вес) разбавляли водой до объема 1мл. Суспензию помешали вцентрифужную пробирку с пришлифованной стеклянной пробкой иприбавляли 3,75мл смеси хлороформ–метанол (1:2, по объему); смесьвстряхивали и оставляли при комнатной температуре на несколько часов,периодически встряхивая. Клетки осаждали центрифугированием, экстрактдекантировалидругуюцентрифужнуюпробиркуобъемом15мл.Микробные клетки снова суспендировали в 4,75мл смеси хлороформ–метанол–вода (1:2:0,8 по объему), смесь встряхивали и центрифугировали.К объединенному супернатанту прибавляли 5мл смеси хлороформа–метанола(1:1,пообъему);слойхлороформаразделялицентрифугированием.
Нижний хлороформный слой разбавляли бензолом и57упаривали досуха в вакууме на роторном испарителе (30–35оС). Остатоклипидов сразу же растворяли в смеси хлороформ – метанол (1:1, пообъему), раствор центрифугировали и доводили хлороформом до нужногообъема.2.6. Клеточносвязанный гексадеканДля удаления избыточного н-гексадекана с внешней поверхностиклеток к 1г биомассы добавляли 5–10мл смеси этанол–бутанол–хлороформ(10:10:1, по объему) и ресуспензировали.
После чего суспензиюцентрифугировали в течение 10мин при 10000g. Промывание проводилидважды. К полученному осадку добавляли 5 – 10мл 5М NaOH, и оставлялина ночь, после чего, смесь экстрагировали дихлорметаном два раза.Экстрактпросушивалинадбезводнымсульфатомнатрия,затемрастворители выпаривали на роторном испарителе при температуре 40 оС идавлении 0,2 атм досуха. Содержание клеточносвязанного гексадеканаанализировали методом газовой хроматографии [96].2.7 Выделение внеклеточных биосурфактантовБиосурфактантывыделялиизбесклеточногосупернатантаэкстракцией смесью хлороформ – метанол (3:1, по объему).
Перед этимбесклеточный супернатант подкисляли соляной кислотой до рН2 иоставляли на ночь при 4°C. Экстракцию проводили из равного объѐмапробы. Нижний органический слой отбирали, растворитель удаляли наротационном испарителе ИР-1М2 (Химлаборприбор, Россия) при 35°С и0,2атм. Незадолго до окончания упаривания к смеси добавляли бензол иупаривали досуха.2.8 Тонкослойная хроматография гликолипидовРазделение липидных компонентов проводили на пластинах TLCSilica gel 60 F254 (Merck, Германия). В качестве подвижной фазыиспользовали систему хлороформ – метанол – вода (65:15:2, по объему).58Для обнаружения гликолипидов пластинки обрабатывали нафтольнымреагентом (0,5г α-нафтола в 100мл смеси метанол – вода, 1:1), затем 10%концентрированной сернойкислотойи нагревали при 110°С домаксимального проявления окраски [7].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
