Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091621), страница 9

Файл №1091621 Диссертация (Гликолипидные биосурфактанты, продуцируемые нефтеокисляющими бактериями рода RHODOCOCCUS при пониженной температуре структура, свойства, роль в процессе биодеградации гидрофобных субстрато) 9 страницаДиссертация (1091621) страница 92018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

Только некоторые из них являются коммерческидоступными, поэтому растет интерес к разработке биотехнологийполучения других биосурфактантов. Актиномицеты, к которым относятсябактерии рода Rhodococcus, являются эффективными продуцентамитрегалолипидов, которые выполняют различные функции, в том числеявляютсябиосурфактантамигидрофобныхсубстратов.иобеспечиваютРодококкиспособныбиодоступностьадаптироватьсякэкстремальным условиям окружающей среды, в том числе к пониженнымтемпературам. Они используют гидрофобные соединения в качествесубстратов. Сукцинилтрегалолипиды, продуцируемые родококками при18-30оС,температурахэмульгирующейобладаютактивностью,чтовысокойповерхностнойопределяетихроль,икакбиосурфактантов, в процессе биодеградации гидрофобных субстратов.Однако нам не удалось найти никакой информации о природебиосурфактантов, продуцируемых бактериями рода Rhodococcus припониженной температуре.

Таким образом, Определение структуры исвойств биосурфактантов, продуцируемых родококками при пониженнойтемпературе, и обоснование потенциала применения биосурфактантов дляутилизации углеводородов является актуальной задачей.Длявыявленияспособностибактерийпродуцироватьбиосурфактанты существуют различные скрининговые методы. Наиболее52простым в исполнении и достоверным является метод определенияповерхностногонатяжениянаграницераздела«вода-воздух».Гликолипиды можно обнаружить качественными реакциями с фенолами.Для выделения и очистки используют метод экстракции полярнымирастворителями и адсорбционную хроматографию на силикагеле. Длявыделенияиндивидуальныхвысокоэффективнойкомпонентовхроматографии.используютХимическуюметодыструктуругликолипидов определяют с помощью комплекса методов, таких как массспектрометрия,жирнокислотныйанализ.использованы в работе.53Всеэтиметодыбыли2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты исследования и условия культивированияМикроорганизмы и условия культивированияШтаммы Rhodococcus erythropolis X5 и Rhodococcus erythropolis S67выбраны из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН.Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г.Пущино)подномерамиВКМАс-2532ДиВКМАс-2532Д,соответственно. Бактерии входят в состав биопрепарата «МикроБак»,который используют для биоремедиации нефтезагрязненных территорий[156]Питательные среды и условие культивированияМикроорганизмы культивировали в жидкой минеральной средеЭванса [158] и полноценной среде Лурия-Бертани [158], состав которыхприведен в таблице (6).Таблица 6.

Состав питательных средСостав питательной среды Лурия-Бертани (на 1 литр воды)П/пКомпонентыСостав, г1Тритон102Дрожжевый экстракт53Натриевый хлорид (NaCl)10Состав минимальной минеральной среды Эванса (на 1 литр воды)П/пКомпонентыСоставK2HPO418,71г5М раствор NH4Cl21 мл0,1М раствор Na2SO431 мл62мМ раствор MgCl241 мл1мМ раствор CaCl251 мл0,005мМ раствор (NH4)6Mo7O2461 мл7Микроэлементы (состав в 1% растворе HCl, 1 млг/л: ZnO - 0,41; FeCl2 -2,9; MnCl2 - 1,28; CuCl2 0,13; CoCl2 - 0,26; H3BO17 - 0,06)54Готовые среды титровали соляной кислотой до рН 7.0.

Готовуюсреду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 116°С и давлении0,5 атм. В среду добавляли субстрат (н-гексадекан, дизельное топливо,глюкоза; 2%, по объему) в качестве единственного источника углерода иэнергии.Бактерии выращивали в жидкой питательной среде ЛБ в течение 24часов для получения инокулята. Культивирование микроорганизмовпроводили в колбах Эрленмейера объѐмом 750мл при 26 оС и 10оС наорбитальной (180об/мин) качалке Excella 25 (Eppendorf, Германия).2.2 Рост микроорганизмов и продуцирование биосурфактантовРост микроорганизмов определяли по изменению оптическойплотности (ОП600нм).Поверхностное натяжение бесклеточного супернатанта измеряли натензиометре Kruss K6 (Kruss, Германия) методом отрыва кольца Дю Нуипри температуре 25°С [7].Содержание биосурфактанта оценивали по концентрации сахаров вкультуральной среде бактерий. Для этого определяли их содержаниеколориметрическимметодомпослевзаимодействиясфенольнымреактивом [153].

Бесклеточную среду (супернатант) супернатант получалицентрифугированием культуральной среды на центрифуге TG16WS(Поликом, Россия) при 10 000g в течение 10мин при 4оС. Супернатанта(500мкл) помещали в пробирку, добавляли 500мкл 5% раствора фенола вводе. При интенсивном перемешивании вносили 2,5мл концентрированнойсерной кислоты (р=1,84г/мл), оставляли на 10мин. Измерение оптическойплотности полученного раствора проводили при длине волны 480нм нафотометре Эксперт - 003 (Эконикс-Эксперт, Россия).

Раствор сравненияготовили аналогично, заменяя пробу дистиллированной водой.Индексэмульгированиябесклеточнойсредыопределялипометодике [134]. В мерную пробирку к 4,0мл супернатанта добавляли 4,0мл55гидрофобного субстрата (н-гексадекана). Полученную смесь интенсивноперемешивали в течение двух минут и оставляли на 1 и 24 часа прикомнатной температуре. Индекс эмульгирования определяли через 1 (Е1) и24 часа (Е24) и рассчитывали по формуле:=× 1000Где: E – индекс эмульгирования (%), H(e) – высота слоя образуемойэмульсии, H (0) – высота полного слоя жидкости.2.3 Гидрофобность клеточной поверхности микроорганизмовГидрофобность определяли по МATH-тесту (Microbial Adherence toHydrocarbon) [159] с модификациями [160] . Культуральную жидкостьцентрифугировали в течение 10мин., при 10000g на центрифуге TG16WS(Поликом,Россия).Клеточнуюбиомассудваждыотмываливдистиллированной воде и ресуспендировали в фосфатно-магниевом буфере(г/л) – 22,2g K2HPO4.3H2O; 7,26g KH2PO4; 1,8g мочевина; 0,2g MgSO4.7H2O(рН=7,0).

При этом значение оптической плотности (ОП600нм) клеточнойсуспензии всех образцов должна быть в пределе 0,48 – 0,50. К 3,0млклеточной суспензии добавляется 0,5мл н-гексадекана. Содержимоепробирок интенсивно встряхивали в течение 3 минуты на шейкере при2000об/мин. После отстаивания в течение 10мин при комнатнойтемпературе происходило разделение водной и углеводородной фазы.Пробу аккуратно отделяли от водной фазы и измеряли оптическуюплотность водной фазы при 600нм. Степень адгезии клеток рассчитывалипо формуле: % = 1−0× 10056где: Н(%) – гидрофобность клеточной поверхности (%);A0, A –оптическая плотность клеточной суспензии до и после добавления нгексадекана, соответственно.2.4 Трансмиссивная электронная микроскопияКлетки бактерий фиксировали в 1,5%-ном растворе глутаровогоальдегида в 0,05 М какодилатном буфере (рН 7,2) при 4°С в течение 1ч,трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1%ном растворе OsO4 в 0,05М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 3ч при20°С.

После обезвоживания материал заключали в эпоксидную смолуEpon-812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки иконтрастировали в течение 30мин в 3%-ном растворе уранилацетата в70%-ном спирте и дополнительно окрашивали цитратом свинца поРейнольдсу [161].2.5 Содержание общих липидов клеток бактерийСуммарныеклеточныелипидыэкстрагировалиполярнымиорганическими растворителями из влажной биомассы бактерий пометодике [162] с модификацией после удаления избытка н-гексадеканагексаном.

Влажную биомассу, содержащую 40 – 50 мг клеток (в расчете насухой вес) разбавляли водой до объема 1мл. Суспензию помешали вцентрифужную пробирку с пришлифованной стеклянной пробкой иприбавляли 3,75мл смеси хлороформ–метанол (1:2, по объему); смесьвстряхивали и оставляли при комнатной температуре на несколько часов,периодически встряхивая. Клетки осаждали центрифугированием, экстрактдекантировалидругуюцентрифужнуюпробиркуобъемом15мл.Микробные клетки снова суспендировали в 4,75мл смеси хлороформ–метанол–вода (1:2:0,8 по объему), смесь встряхивали и центрифугировали.К объединенному супернатанту прибавляли 5мл смеси хлороформа–метанола(1:1,пообъему);слойхлороформаразделялицентрифугированием.

Нижний хлороформный слой разбавляли бензолом и57упаривали досуха в вакууме на роторном испарителе (30–35оС). Остатоклипидов сразу же растворяли в смеси хлороформ – метанол (1:1, пообъему), раствор центрифугировали и доводили хлороформом до нужногообъема.2.6. Клеточносвязанный гексадеканДля удаления избыточного н-гексадекана с внешней поверхностиклеток к 1г биомассы добавляли 5–10мл смеси этанол–бутанол–хлороформ(10:10:1, по объему) и ресуспензировали.

После чего суспензиюцентрифугировали в течение 10мин при 10000g. Промывание проводилидважды. К полученному осадку добавляли 5 – 10мл 5М NaOH, и оставлялина ночь, после чего, смесь экстрагировали дихлорметаном два раза.Экстрактпросушивалинадбезводнымсульфатомнатрия,затемрастворители выпаривали на роторном испарителе при температуре 40 оС идавлении 0,2 атм досуха. Содержание клеточносвязанного гексадеканаанализировали методом газовой хроматографии [96].2.7 Выделение внеклеточных биосурфактантовБиосурфактантывыделялиизбесклеточногосупернатантаэкстракцией смесью хлороформ – метанол (3:1, по объему).

Перед этимбесклеточный супернатант подкисляли соляной кислотой до рН2 иоставляли на ночь при 4°C. Экстракцию проводили из равного объѐмапробы. Нижний органический слой отбирали, растворитель удаляли наротационном испарителе ИР-1М2 (Химлаборприбор, Россия) при 35°С и0,2атм. Незадолго до окончания упаривания к смеси добавляли бензол иупаривали досуха.2.8 Тонкослойная хроматография гликолипидовРазделение липидных компонентов проводили на пластинах TLCSilica gel 60 F254 (Merck, Германия). В качестве подвижной фазыиспользовали систему хлороформ – метанол – вода (65:15:2, по объему).58Для обнаружения гликолипидов пластинки обрабатывали нафтольнымреагентом (0,5г α-нафтола в 100мл смеси метанол – вода, 1:1), затем 10%концентрированной сернойкислотойи нагревали при 110°С домаксимального проявления окраски [7].

Характеристики

Список файлов диссертации

Гликолипидные биосурфактанты, продуцируемые нефтеокисляющими бактериями рода RHODOCOCCUS при пониженной температуре структура, свойства, роль в процессе биодеградации гидрофобных субстрато
Документы
Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6358
Авторов
на СтудИзбе
311
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее