Диссертация (1091621), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Эмульгирующая активность бесклеточнойсреды штамма X5 выше, чем у штамма S67, что коррелирует споверхностной активностью среды. Более высокая поверхностная иэмульгирующая активность среды может способствовать росту биомассына гидрофобном субстрате в виде планктонной культуры.Таблица 12. Индекс эмульгирования бесклеточной среды бактерийродококков X5 и S67, выращенных на н-гексадекане при температурах26оС и 10оС во время стационарной фазы ростаИндекс эмульгирования(E), %E1E24штамм X510 C26oC50633655oштамм S6710 C26oC5439836oВ ряде работ установлено, что индекс эмульгирования бесклеточнойсреды бактерий разных штаммов рода Rhodococcus при росте нагидрофобных субстратах к н-гексадекану, находится в диапазоне от 20 до80% [7, 97, 166, 100] что характерно и для бактерий X5 и S67.При низкой температуре культивирования значительно уменьшаетсяспособностьбактерийS67продуцироватьбиосурфактантывкультуральную среду (биосурфактанты экзотипа).
Следует отметить, чтопри пониженной температуре гексадекан находится в твердом агрегатном73состоянии, и большая часть твердого субстрата локализована наповерхности жидкости. Этим может быть обусловлено незначительноеуменьшение поверхностной и низкое значение эмульгирующей активностисреды при пониженной температуре. Существенную роль в утилизациигидрофобныхсубстратов принизкихтемпературах может игратьувеличение гидрофобности поверхности клеток [5].
Для выяснения ролигидрофобностиклеточнойповерхностибактерийвадаптациинефтеокисляюших бактерий R. erythropolis к низким температурамопределяли этот показатель при 26оС и 10оС.Адгезивная3.3активностьбактерийR.erythropolisX5иR.erythropolis S67Начальнымэтапомпроцессабиотрансформациилюбогогидрофобного соединения является бактериальная адгезия к гидрофобнымсубстратам, тем более к твердым субстратам. Основными механизмамиадаптациимикроорганизмовкусвоениюгидрофобныхсубстратовявляется: повышение степени гидрофобности клеточной поверхности, чтообеспечивает прямой контакт клеток с каплями углеводородов и/илисинтез биосурфактантов, которые способны эмульгировать гидрофобныйсубстрат в ростовой среде и обеспечивать опосредованный контакт клетокс каплями углеводородов.Вомногомстепеньадгезиизависитотсодержанияклеточносвязанных биосурфактантов [84].
При росте на гексадеканестепень гидрофобности клеточной поверхности бактерий S67 составила73% и 88% в экспоненциальной фазе роста при 26оС и 10оС, выше чем убактерий X5 – 63% при 26оС и 73% при 10оС (рис. 17). В работе [165]продемонстрировано, что клетки бактерийR. erythropolisNTU-1,выращенные на гексадекане при 30оС (рН7), обладает гидрофобностью68%, а при рН4 – 84% после 36 часов культивирования. Авторы доказали,что кислотность культуральной среды может повышать гидрофобность74клеточной поверхности или адгезивную способность клеток при росте нагидрофобных субстратах [165]. В нашей работе высокая гидрофобностьклеток штамма S67 способствует их биофлоктуляции и формированиюслоя биомассы на поверхности среды в условиях снижения рН в ходекультивирования, что экспериментально подтверждает предположения,выдвинутые Чангом [165].При пониженной температуре степень гидрофобности клеточнойповерхности увеличивается, что способствует адгезии клеток к твердомусубстрату.
Ранее было показано, что у некоторых штаммов родококковадгезивная активность возрастает на 25 – 30% при снижении температурыкультивирования до 17оС [88]. Авторы предположили, что это являетсяодним из механизмов выживания алканотрофных родококков в холодныхклиматических условиях.Рисунок 17. Степень адгезии клетки бактерий R. erythropolis X5 (а) иS67 (б) при росте на н-гексадекане в условиях температуры 26оС и 10оСВысокая степень гидрофобности клеточной поверхности у обоихштаммов указывает на то, что для этих бактерий характерен прямойконтакт со слоем гидрофобного субстрата и пассивно-диффузный егоперенос в клетку. Следует отметить, что после выхода на стационарнуюфазу роста гидрофобность клеточной поверхности бактерий X5 и S67снижается как при 26˚С, так и при 10˚С.
Это может быть связано с75перераспределением продуцируемых биосурфактантов между клеточнойповерхностью и средой. Мы предполагаем, что гликолипиды, связанныепервоначально с клеточной поверхностью, поступают в культуральнуюсреду,чтоприводиткувеличениюсодержаниявнеклеточныхгликолипидов в стационарной фазе роста бактерий (рисунок 15, кривая 2).Сравнение степени гидрофобности клеточной поверхности и содержаниявнеклеточных биосурфактантов позволило выявить общую тенденцию куменьшению гидрофобности при увеличении количества продуцируемыхбиосурфактантов в культуральную среду. Авторы [84] наблюдали такуюзависимость при росте бактерий рода Gordonia на н-гексадекане.Полученные нами результаты согласуются с гипотезой о том, чтомикроорганизмы,образующиебиосурфактанты,способныизменятьповерхностные свойства клетки [9].
Таким образом, клеточносвязанныегликолипиды могут способствовать адгезии бактерий на гидрофобныхсубстратах, что важно на первой стадии культивирования, когда в средееще отсутствует продукты частичной деградации н-гексадекана ивторичныеметаболитымикроорганизмов.Сдругойстороны,гидрофобность клеточной поверхности обеспечивается присутствием вклеточной стенке не только гликолипидов.
Известно, что состав клеточныхлипидов играет важную роль в адаптации бактерий к неблагоприятнымусловиям внешней среды [121]. Уникальность актинобактерий состоит втом, что внешний липидный барьер проницаемости для гидрофобныхсубстратоввклеткуунихформируютвысокомолекулярныегидроксикислоты - миколовые кислоты и их эфиры с трегалозой, которыеспособствуютпроникновениюуглеводородоввклеткупассивно-диффузным путем, и увеличивается общее содержание липидов.
Крометого,припониженнойтемпературепроисходитизменениежирнокислотного состава мембранных липидов. Для выяснения такихизменений у бактерий R. erythropolis S67 и R. erythropolis X5 при76пониженнойтемпературеростаопределялиобщеесодержаниеижирнокислотный состав липидов бактерий.3.4 Общее содержание и жирнокислотный состав липидов бактерийи внеклеточных липидов3.4.1 Выделение и характеристика суммарных липидов бактерийМембранные липиды и липидные включения (см. п.3.4) являютсясоставной частью общих липидов клеток. Для выявления роли липидов вадаптации родококков к пониженным температурам окружающей средыисследовали содержание и жирнокислотный состав липидов бактерий,выращенных на гексадекане при 26оС и 10оС в сравнении.
Липидыэкстрагировали из биомассы бактерий по схеме (рис. 18).Избыток гексадекана экстрагировали гексаном из культуральнойсреды с бактериями, после чего отделяли биомассу микроорганизмовцетрифугированием. К осадку биомассы добавляли смесь хлороформа сметанолом для экстрагирования липидов. Экстракцию повторяли дважды,затем отделяли воду из экстракта путем добавления избытка хлороформа.Высушенный от воды хлороформный экстракт липидов упаривали нароторном испарители и анализировали.77Рисунок 18. Схема выделения липидов из биомассы бактерийКоличество накопленных липидов у обоих штаммов бактерий,выращенных при 10˚С значительно выше, чем у бактерий, культивируемыхпри 26˚С (рис.19). Общее содержание клеточных липидов в биомассештамма X5 выше, чем в биомассе штамма S67 как при 26оС, так и при10оС. Максимальное значение составило 169 и 115мг/г(биомассы) (X5), 145 и94мг/г(биомассы) (S67) в экспоненциальной фазе роста при 10оС и 26оС,соответственно.
Другие исследователи также продемонстрировали, чтопсихотрофныеRhodococcusадаптировалиськроступринизкойтемпературе за счет увеличения содержания липидов и уменьшения ихстепени насыщения для сохранения оптимальной текучести мембран78[110]. Полученные результаты согласуются с общим механизмомвыживания бактерий в холодных условиях за счет увеличения липидов вклетках бактерий, которые служат для запасания энергии и защиты клетокот замораживания.Рисунок 19. Содержание общих липидов бактерий R. erythropolis X5 (а)и R.erythropolis S67 (б), выращенных на н-гексадекане при 26оС и 10оС.Липидныйэкстрактохарактеризовалинафосфолипиды,гликолипиды и ненасыщенные липиды методом ТСХ с помощьюспецифических реагентов (рис. 20).Рисунок 20.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
