Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1091621), страница 10

Файл №1091621 Диссертация (Гликолипидные биосурфактанты, продуцируемые нефтеокисляющими бактериями рода RHODOCOCCUS при пониженной температуре структура, свойства, роль в процессе биодеградации гидрофобных субстрато) 10 страницаДиссертация (1091621) страница 102018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Гликолипиды проявлялись в видесине-фиолетовых пятен.Определение2.9жирнокислотногосоставалипидовибиосурфактантаСодержание жирнокислотных состав биосурфактантов или липидовопределяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическимдетектором (ГХ-МС). Для этого проводили переэтерификацию эфировжирных кислот метанолом по методике [26] с модификацией. Навескуобразца (10мг для биосурфактанта и 30мг для липидов) ресуспендировалив 2 мл смеси концентрированной серной кислоты - метанол (5% по объему)и нагревали при 60оС в течение 2 часов.

После охлаждения экстрагировали5 мл диэтилового эфира. Остаток серной кислоты в экстракте отмывалидистиллированной водой до нейтрального значения pH. Упаренныйобразецрастворяливхлороформеианализировалиспомощьюхроматографа Agilent 6890N (Agilent Technologies Inc., США) с массспектрометрическим детектором Agilent 5973 на капиллярной колонке XP1 (30м x 25мм x 25µм) с градиентом температуры от 50 до 290оС в течение40оС мин-1, затем держали 30мин при 290оС. Гелий используется в качествегаз-носителя.Жирные кислоты идентифицировали по базе данныхNIST/EPA/NIH (http://www.nist.gov/srd/nist1a.cfm).2.10РазделениетрегалолипидовметодомколоночнойхроматографииОчистку биоПАВ, входящих в состав липидного экстракта,проводили в два этапа по методике, описанной в работе [16]. На первомэтапеудалялигексадекангексаномсиспользованиемфлэш-хроматографии. Для этого стеклянную колонку 5×5см заполняли смесью59силикагеля Kiesegel 60 (Merk, Германия) в смеси с гексаном, так чтобымасса силикагеля была в 20 раз больше наносимого образца.

Гексадеканэлюировалигексаном (20мл), очищенные от гексадекана липидыэлюировали хлороформом и упаривали растворитель на роторномиспарителе.Навторомэтапеочищалиосновнойгликолипидныйкомпонент методом колоночной хроматографии. Для этого использовалистекляннуюхроматографическуюколонку1x20см,заполненнуюсиликагелем Kiesegel 60 (Merk, Германия) с хлороформом. Образецлипидов растворяли в минимальном объеме смеси хлороформ – метанол(2:1) и наносили на колонку. Промывали колонку хлороформом (15мл),затем системами хлороформ – метанол (10:1) (20мл) и хлороформ –метанол – уксусная кислота (5:1:0.01) (10мл) для удаления примесей жирови полярных липидов. Гликолипиды элюировали смесью хлороформ –метанол (10:3) (10 мл) и (10:4) (10 мл) в пробирки по 2 мл.

Содержаниецелевого гликолипида в пробах определяли методом ТСХ (см. 2.7).Объединяли содержимое пробирок с очищенным целевым веществом (Rf0,35) и упаривали растворитель на роторном испарителе.2.11 Определение структуры биосурфактантов методом массспектрометрииСтруктуру выделенных гликолипидов идентифицировали методоммасс-спектрометрииScientific,Германия).сиспользованиемДляэтого,масс-спектрометрарастворяли10мг(Thermoочищенногогликолипида в особо чистом (HPLC) метаноле (Merk, Германия).Ионизациюэлектрораспылением(ESI-MS)положительных и отрицательных зарядов.проводиливрежимеПолные масс-спектрысканировали от m/z 100 по m/z 2000.

Тандемную масс-спектрометрию(МС/МС) проводили в положении иона-предшественника с m/z 871, m/z899 в режиме положительного заряда, а в отрицательном - с m/z 875, m/z60847, для фрагментации использовали HCD. МС/МС сканировали винтервале от m/z 50 по m/z 1500.2.12 Физико-химические свойства трегалолипидовКритическая концентрация мицеллообразования (ККМ): ККМтрегалолипидаопределялиочищенноготрегалолипидаразбавленияполучалибиосурфактантапоссериюнаходилисьметодикеконцентрациейобразцов,вГотовили[27].винтервале500мг/л.которыхрастворМетодомконцентрации0–500мг/л,измерялиповерхностное натяжение каждого образца на тензиометре Kruss K6(Kruss, Германия).

ККМ определяли по точке перегиба на кривыхзависимостях поверхностного натяжения от концентрации.Гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ): ГЛБ (в шкале от 0 по 20)определялипоотношениюмассыгидрофильнойчастимолекулыбиосурфактанта к массе общей молекулы по формуле [25]:ГЛБ = 20 ×молекулярная масса гидрофильной частиобщая молекулярная масса биосурфактантаВеличину поверхностной адсорбции вычисляли по уравнению [163]Γ=1 1=. 2.303. .

где Г - поверхностная адсорбция (моль/м2); С – концентрациябиосурфактанта (моль/л); R - газовая постоянная (R=8,31 Дж/моль. К); Т –температура (К); σ – поверхностное натяжение (Н/м).Значение минимальной площади (Smin) молекулярной области,занимающей насыщенным монослоем биосурфактанта на границе водавоздух и вода – н-гексадекан, вычисляли по формуле [163]:611020= . Γгде Smin–минимальная площадь одной молекулы биосурфактанта вповерхностном/межфазном адсорбционном слое (м2); NA – число Авогадро(6,023. 1023 моль–1); Г – поверхностная адсорбция (моль/м2).Свободную энергию мицеллообразования рассчитывали на основеуравнения:Δ = . .

(ККМ)молргде ∆G – свободная энергия мицеллообразования (кДж/моль); R –газовая постоянная (R=8,31 Дж/моль К); Т – температура (К); ККМ критическая концентрация мицеллообразования (М); молр-молярностьрастворителя (в случае использовали воду в качестве растворителя, молр =55,5).Солюбилизациян-гексадеканатрегалолипидами:Впробиркиобъѐмом 25 мл вносили раствор трегалолипидов в концентрации 0,05; 0,1 и0,2г/л; 0,3г/л (таб. 7). После этого добавляли н-гексадекан (300мкл). Дляприготовления контрольных растворов в пробирки к дистиллированнойводе добавляли только н-гексадекан. Общий объѐм полученных растворовсоставлял 15мл.Таблица 7.

Объем растворов и воды для приготовления сериианализируемые растворов.Номерраствора12345КонцентрациябиоПАВ,г/л00,050,10,20,3ПробиркисОбъем водного Объемн- Объемрастворагексадекана, дистиллированнойбиосурфактанта млводы, мл, мл00,315,0000,0750,314,9250,1500,314,8500,3000,314,7000,4500,314,550полученнымирастворамиплотнозакрывалирезиновыми пробками и помещали для перемешивания на качалку на 24и 72 часа при температуре 26оС.

После перемешивания отделяли водную62фазу(солюбилизированныйн-гексадекан)отгидрофобнойфазы(исходный н-гексадекан) с помощью делительной воронки. Количествосолюбилизированногон-гексадеканаопределялиспомощьюгазохроматографического метода анализа.2.13 Биодеградация н-гексадеканаСтепень деградации н-гексадекана бактериями Rhodococcus штаммовX5 и S67 оценивали по убыли начального содержания субстрата в средечерез 3, 6, 8 суток при 26оС и 6, 12, 18 суток при 10оС. Для этогопроводили экстракцию из культуральной среды равным объемом гексана(10мл) и определяли содержание н-гексадекана с помощью газовогохроматографа Кристалл-5000 (Хроматек-Аналитик, Россия) с капиллярнойколонкой BP1J08 (30m x 0.3mm x 0.53µm).Таблица 8.

Условия анализаТемпература колонки, оС250Температура испарителя, оС300Температура детектора, оС250Расход газа-носителя (азот), мл/мин174,6Объем пробы, µл10Время анализа, мин10Приборградуировалипоискусственнымсмесямметодомабсолютной градуировки. Для анализа готовили шесть стандартныхрастворов, содержащих 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 и 10% гексадекана. Для этого вмерные колбы с притертыми крышками вместимостью 25см3 вносилисоответственно 125; 250; 625; 1250; 1875 и 2500мкл гексадекана. Доводилиобъем до метки гексаном и перемешивали.Для определения остаточной концентрации гексадекана каждуюпробу обрабатывали следующим образом: в колбу с культуральнойжидкостью с помощью градуированной пипетки помещали 10мл гексана,63закрывали пробкой и интенсивно встряхивали в течение 1 минуты.

Послеотслоения фаз пипеткой отбирали верхний слой и переносили в колбу спритертой крышкой на 50мл. С помощью микрошприца в испарительвводили пробу и анализировали в условиях, указанных в таблице 8.Регистрировали не менее двух хроматограмм анализируемой пробы.Содержание гексадекана в образцах определяли по градуировочномуграфику, который выражал зависимость площади пика от содержания нгексадекана.Степень деградации гексадекана рассчитывали по следующейформуле:Д (%) =С1 − С0∙ 100%С0где С1- концентрация гексадекана в культуральной жидкости (% отобъема среды)С0 – концентрация гексадекана в контрольной пробе (% от объемасреды).643.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯИсследования в рамках диссертационной работы можно разделить нанесколько взаимосвязанных этапов (рис. 14).Рисунок 14. Общая схема исследовательской работы65Первоначально проводили сравнительный анализ способностинефтеокисляющих родококков продуцировать биосурфактанты при 26 оС и10оС.Параллельновыяснялиповерхностно-активныхвзаимосвязьвеществимеждусахаров,содержаниемпродуцируемыхмикроорганизмами в среду в зависимости от фазы роста. Для этого черезопределенныепромежуткимикроорганизмов(поверхностноевремениопределялинатяжениевпроцессефизико-химическиенаграницеразделакультивированияпоказателисреды«среда-воздух»исодержание сахаров с помощью фенольного реагента колориметрическимметодом).

На основе изучения методом трансмиссионной электронноймикроскопииморфологическихособенностейимикроструктурнойорганизации клеток родококков, выращенных на гексадекане припониженной температуре, а также физико-химических свойств клеточнойповерхности и жирнокислотного состава липидов в бесклеточной среде,выявляли особенности адаптации родококков к росту на твердыхгидрофобныхсубстратахиучастиявэтомбиосурфактантов.Качествекнный анализ гликолипидов, продуцируемых бактериями в средупри 26оС и 10оС, проводили методом тонкослойной хроматографии.Значительная часть работы была посвящена выделению, очистке иидентификации основных гликолипидных компонентов в культуральнойсреде бактерий.

Для этого использовали методы хроматографии и массспектрометрии. Полученные данные анализировали с использованием базданныхпомасс-спектрамлипидов.Физико-химическиеметодыиспользовали для характеристики выделенного сукцинилтрегалолипидакакбиосурфактанта.Напоследнемэтапепроводилимодельныйэксперимент по биодеградации гексадекана бактериями при комнатной ипониженной температуре в присутствии дополнительных количествгликолипидных биосурфактантов для выявления их потенциала приразработке биотехнологий очистки нефтезагрязненных территорий.663.1 Рост бактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 и ихспособность продуцировать биосурфактанты в зависимости отисточника углеродаДля выбора модельного субстрата в дальнейших исследованияхбактерии R.

Характеристики

Список файлов диссертации

Гликолипидные биосурфактанты, продуцируемые нефтеокисляющими бактериями рода RHODOCOCCUS при пониженной температуре структура, свойства, роль в процессе биодеградации гидрофобных субстрато
Документы
Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее