Диссертация (1091621), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Гликолипиды проявлялись в видесине-фиолетовых пятен.Определение2.9жирнокислотногосоставалипидовибиосурфактантаСодержание жирнокислотных состав биосурфактантов или липидовопределяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическимдетектором (ГХ-МС). Для этого проводили переэтерификацию эфировжирных кислот метанолом по методике [26] с модификацией. Навескуобразца (10мг для биосурфактанта и 30мг для липидов) ресуспендировалив 2 мл смеси концентрированной серной кислоты - метанол (5% по объему)и нагревали при 60оС в течение 2 часов.
После охлаждения экстрагировали5 мл диэтилового эфира. Остаток серной кислоты в экстракте отмывалидистиллированной водой до нейтрального значения pH. Упаренныйобразецрастворяливхлороформеианализировалиспомощьюхроматографа Agilent 6890N (Agilent Technologies Inc., США) с массспектрометрическим детектором Agilent 5973 на капиллярной колонке XP1 (30м x 25мм x 25µм) с градиентом температуры от 50 до 290оС в течение40оС мин-1, затем держали 30мин при 290оС. Гелий используется в качествегаз-носителя.Жирные кислоты идентифицировали по базе данныхNIST/EPA/NIH (http://www.nist.gov/srd/nist1a.cfm).2.10РазделениетрегалолипидовметодомколоночнойхроматографииОчистку биоПАВ, входящих в состав липидного экстракта,проводили в два этапа по методике, описанной в работе [16]. На первомэтапеудалялигексадекангексаномсиспользованиемфлэш-хроматографии. Для этого стеклянную колонку 5×5см заполняли смесью59силикагеля Kiesegel 60 (Merk, Германия) в смеси с гексаном, так чтобымасса силикагеля была в 20 раз больше наносимого образца.
Гексадеканэлюировалигексаном (20мл), очищенные от гексадекана липидыэлюировали хлороформом и упаривали растворитель на роторномиспарителе.Навторомэтапеочищалиосновнойгликолипидныйкомпонент методом колоночной хроматографии. Для этого использовалистекляннуюхроматографическуюколонку1x20см,заполненнуюсиликагелем Kiesegel 60 (Merk, Германия) с хлороформом. Образецлипидов растворяли в минимальном объеме смеси хлороформ – метанол(2:1) и наносили на колонку. Промывали колонку хлороформом (15мл),затем системами хлороформ – метанол (10:1) (20мл) и хлороформ –метанол – уксусная кислота (5:1:0.01) (10мл) для удаления примесей жирови полярных липидов. Гликолипиды элюировали смесью хлороформ –метанол (10:3) (10 мл) и (10:4) (10 мл) в пробирки по 2 мл.
Содержаниецелевого гликолипида в пробах определяли методом ТСХ (см. 2.7).Объединяли содержимое пробирок с очищенным целевым веществом (Rf0,35) и упаривали растворитель на роторном испарителе.2.11 Определение структуры биосурфактантов методом массспектрометрииСтруктуру выделенных гликолипидов идентифицировали методоммасс-спектрометрииScientific,Германия).сиспользованиемДляэтого,масс-спектрометрарастворяли10мг(Thermoочищенногогликолипида в особо чистом (HPLC) метаноле (Merk, Германия).Ионизациюэлектрораспылением(ESI-MS)положительных и отрицательных зарядов.проводиливрежимеПолные масс-спектрысканировали от m/z 100 по m/z 2000.
Тандемную масс-спектрометрию(МС/МС) проводили в положении иона-предшественника с m/z 871, m/z899 в режиме положительного заряда, а в отрицательном - с m/z 875, m/z60847, для фрагментации использовали HCD. МС/МС сканировали винтервале от m/z 50 по m/z 1500.2.12 Физико-химические свойства трегалолипидовКритическая концентрация мицеллообразования (ККМ): ККМтрегалолипидаопределялиочищенноготрегалолипидаразбавленияполучалибиосурфактантапоссериюнаходилисьметодикеконцентрациейобразцов,вГотовили[27].винтервале500мг/л.которыхрастворМетодомконцентрации0–500мг/л,измерялиповерхностное натяжение каждого образца на тензиометре Kruss K6(Kruss, Германия).
ККМ определяли по точке перегиба на кривыхзависимостях поверхностного натяжения от концентрации.Гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ): ГЛБ (в шкале от 0 по 20)определялипоотношениюмассыгидрофильнойчастимолекулыбиосурфактанта к массе общей молекулы по формуле [25]:ГЛБ = 20 ×молекулярная масса гидрофильной частиобщая молекулярная масса биосурфактантаВеличину поверхностной адсорбции вычисляли по уравнению [163]Γ=1 1=. 2.303. .
где Г - поверхностная адсорбция (моль/м2); С – концентрациябиосурфактанта (моль/л); R - газовая постоянная (R=8,31 Дж/моль. К); Т –температура (К); σ – поверхностное натяжение (Н/м).Значение минимальной площади (Smin) молекулярной области,занимающей насыщенным монослоем биосурфактанта на границе водавоздух и вода – н-гексадекан, вычисляли по формуле [163]:611020= . Γгде Smin–минимальная площадь одной молекулы биосурфактанта вповерхностном/межфазном адсорбционном слое (м2); NA – число Авогадро(6,023. 1023 моль–1); Г – поверхностная адсорбция (моль/м2).Свободную энергию мицеллообразования рассчитывали на основеуравнения:Δ = . .
(ККМ)молргде ∆G – свободная энергия мицеллообразования (кДж/моль); R –газовая постоянная (R=8,31 Дж/моль К); Т – температура (К); ККМ критическая концентрация мицеллообразования (М); молр-молярностьрастворителя (в случае использовали воду в качестве растворителя, молр =55,5).Солюбилизациян-гексадеканатрегалолипидами:Впробиркиобъѐмом 25 мл вносили раствор трегалолипидов в концентрации 0,05; 0,1 и0,2г/л; 0,3г/л (таб. 7). После этого добавляли н-гексадекан (300мкл). Дляприготовления контрольных растворов в пробирки к дистиллированнойводе добавляли только н-гексадекан. Общий объѐм полученных растворовсоставлял 15мл.Таблица 7.
Объем растворов и воды для приготовления сериианализируемые растворов.Номерраствора12345КонцентрациябиоПАВ,г/л00,050,10,20,3ПробиркисОбъем водного Объемн- Объемрастворагексадекана, дистиллированнойбиосурфактанта млводы, мл, мл00,315,0000,0750,314,9250,1500,314,8500,3000,314,7000,4500,314,550полученнымирастворамиплотнозакрывалирезиновыми пробками и помещали для перемешивания на качалку на 24и 72 часа при температуре 26оС.
После перемешивания отделяли водную62фазу(солюбилизированныйн-гексадекан)отгидрофобнойфазы(исходный н-гексадекан) с помощью делительной воронки. Количествосолюбилизированногон-гексадеканаопределялиспомощьюгазохроматографического метода анализа.2.13 Биодеградация н-гексадеканаСтепень деградации н-гексадекана бактериями Rhodococcus штаммовX5 и S67 оценивали по убыли начального содержания субстрата в средечерез 3, 6, 8 суток при 26оС и 6, 12, 18 суток при 10оС. Для этогопроводили экстракцию из культуральной среды равным объемом гексана(10мл) и определяли содержание н-гексадекана с помощью газовогохроматографа Кристалл-5000 (Хроматек-Аналитик, Россия) с капиллярнойколонкой BP1J08 (30m x 0.3mm x 0.53µm).Таблица 8.
Условия анализаТемпература колонки, оС250Температура испарителя, оС300Температура детектора, оС250Расход газа-носителя (азот), мл/мин174,6Объем пробы, µл10Время анализа, мин10Приборградуировалипоискусственнымсмесямметодомабсолютной градуировки. Для анализа готовили шесть стандартныхрастворов, содержащих 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 и 10% гексадекана. Для этого вмерные колбы с притертыми крышками вместимостью 25см3 вносилисоответственно 125; 250; 625; 1250; 1875 и 2500мкл гексадекана. Доводилиобъем до метки гексаном и перемешивали.Для определения остаточной концентрации гексадекана каждуюпробу обрабатывали следующим образом: в колбу с культуральнойжидкостью с помощью градуированной пипетки помещали 10мл гексана,63закрывали пробкой и интенсивно встряхивали в течение 1 минуты.
Послеотслоения фаз пипеткой отбирали верхний слой и переносили в колбу спритертой крышкой на 50мл. С помощью микрошприца в испарительвводили пробу и анализировали в условиях, указанных в таблице 8.Регистрировали не менее двух хроматограмм анализируемой пробы.Содержание гексадекана в образцах определяли по градуировочномуграфику, который выражал зависимость площади пика от содержания нгексадекана.Степень деградации гексадекана рассчитывали по следующейформуле:Д (%) =С1 − С0∙ 100%С0где С1- концентрация гексадекана в культуральной жидкости (% отобъема среды)С0 – концентрация гексадекана в контрольной пробе (% от объемасреды).643.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯИсследования в рамках диссертационной работы можно разделить нанесколько взаимосвязанных этапов (рис. 14).Рисунок 14. Общая схема исследовательской работы65Первоначально проводили сравнительный анализ способностинефтеокисляющих родококков продуцировать биосурфактанты при 26 оС и10оС.Параллельновыяснялиповерхностно-активныхвзаимосвязьвеществимеждусахаров,содержаниемпродуцируемыхмикроорганизмами в среду в зависимости от фазы роста. Для этого черезопределенныепромежуткимикроорганизмов(поверхностноевремениопределялинатяжениевпроцессефизико-химическиенаграницеразделакультивированияпоказателисреды«среда-воздух»исодержание сахаров с помощью фенольного реагента колориметрическимметодом).
На основе изучения методом трансмиссионной электронноймикроскопииморфологическихособенностейимикроструктурнойорганизации клеток родококков, выращенных на гексадекане припониженной температуре, а также физико-химических свойств клеточнойповерхности и жирнокислотного состава липидов в бесклеточной среде,выявляли особенности адаптации родококков к росту на твердыхгидрофобныхсубстратахиучастиявэтомбиосурфактантов.Качествекнный анализ гликолипидов, продуцируемых бактериями в средупри 26оС и 10оС, проводили методом тонкослойной хроматографии.Значительная часть работы была посвящена выделению, очистке иидентификации основных гликолипидных компонентов в культуральнойсреде бактерий.
Для этого использовали методы хроматографии и массспектрометрии. Полученные данные анализировали с использованием базданныхпомасс-спектрамлипидов.Физико-химическиеметодыиспользовали для характеристики выделенного сукцинилтрегалолипидакакбиосурфактанта.Напоследнемэтапепроводилимодельныйэксперимент по биодеградации гексадекана бактериями при комнатной ипониженной температуре в присутствии дополнительных количествгликолипидных биосурфактантов для выявления их потенциала приразработке биотехнологий очистки нефтезагрязненных территорий.663.1 Рост бактерий R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 и ихспособность продуцировать биосурфактанты в зависимости отисточника углеродаДля выбора модельного субстрата в дальнейших исследованияхбактерии R.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
