Диссертация (1091621), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Гидрофобные клетки связываются с капелькамиуглеводорода и поднимаются вместе с ним. Аккуратно выносят воднуюфазу и измеряют оптическую плотность при длине волны 600нм.Снижение мутности водной фазы коррелирует с гидрофобностью клеток.Процент клеток, связанных с гидрофобной фазой (H), рассчитывается поформуле:46где А0 - оптическая плотность суспензии до добавления субстрата; А оптическая плотность водной фазы после добавления субстрата.Количественное определение реплик. Метод разработан Розенберг[149] для идентификации и выделения гидрофобных микроорганизмов.Принцип метода заключается в присоединении бактериальных штаммов кгидрофобномуполистиролу,чтокоррелируетсгидрофобностьюклеточной поверхности.
На плоский стерильный диск из полистиролавносят агар, содержащий колонии для исследования. Колонии, которыепоявились на поверхности полистирола, промывают проточной водой дляудаления всех клеток, не связанных к гидрофобной поверхности. Длявизуализации прилипших колоний они фиксируются и окрашиваются. Длявыделения гидрофобных штаммов реплика может быть перенесена нановую стерильную чашку с агаром. В работе [150] продемонстрировано,что гидрофобность клеточной поверхности сильно коррелирует сосродством к полистиролу. Этот метод является недорогим способомидентификациимассивамикробныхштаммовдляпродукциибиосурфактантов.
Более того, идентификация и выделение потенциальныхштаммов могут быть объединены в один этап исследования.1.3.2 Выделение, характеристика и очистка трегалолипидныхбиосурфактантовДля выделения биосурфактантов из водных сред используют методэкстракции полярными органическими растворителями. Наиболее частоиспользуют системы хлороформ – метанол (2:1; 3:1) [56].
В работе [104]показано, что метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ), менее токсичен посравнению с хлороформом и метанолом, может использовать длявыделения гликолипидных биосурфактантов. Маркуез с соавт. [25]47проводили экстракцию трегалолипидов из бесклеточной среды смесьюэтилацетата – метанола (8: 1).Еще одним подходом для выделения биосурфактантов являетсякислотное осаждение. В работе [61] продемонстрировано, что аналогичноосаждению рамнолипидов и сурфактина можно выделить моно- идисукцинилтрегалолипиды путем изменения рН среды.Для выделения гликолипидов из Rhodococcus sp. H13A использовалиосаждение изопропанолом и фильтрования с использованием мембранныхфильтров [151].
Эта методика предполагает одновременное осаждениебелков,споследующейэкстракциейгликолипидовизосадкаорганическими растворителями.Содержание гликолипидов в культуральной среде или супернатантеможно определить косвенно через содержание сахаров с использованиемантронногореагента[152].Принципколориметрическогоанализазаключается во взаимодействии антронного или настольного реагента состатками сахаров с образованием цветного комплекса, содержаниекоторогоможетбытьопределеноспектрофотометрически.Дляколичественного определения также используют фенольный реагент [153].Однако, этот метод не является специфичным, так как с этими реагентамивзаимодействую любые сахара, находящиеся в культуральной среде,поэтому для специфического определения трегалолипидов следуетприменять методы высокой эффективной жидкостной хроматографии(ВЭЖХ).
Разделение трегалолипидов обычно проводят с использованиемлиботонкослойнойхроматографии(ТСХ),либопрепаративнойколоночной хроматографии.ТСХ - один из наиболее используемых методов для качественнойхарактеристикибиосурфактантов.Вкачествестационарнойфазыиспользуют пластины с силикагелем. Для разделения компонентов в смесигликолипидных биосурфактантов используют системы: хлороформ –48метанол – вода (65:15:2) [54], хлороформ – метанол – уксусная кислота –вода [27] и другие полярные системы, в состав которых входит хлороформкак основной компонент, в котором хорошо растворимы гликолипиды.ТСХширокоиспользуетсядляобнаружениягликолипидовлипидном экстракте, а также для получения информации о типебиосурфактантов (гликолипиды, липопептиды, фосфолипиды и т.д.).
Прииспользовании п-анисового альдегида трегалолипиды будут проявлятьзеленого цвета [54]. Наиболее часто гликолипиды обнаруживают сиспользованием нафтольного регента в виде сине-фиолетовых полос.Крупномасштабнуюиспользованиемочисткуколоночнойгликолипидовхроматографии.Однакопроводятэтосявляетсятрудоемкой задачей, так как трегалолипиды, обычно, являются минорнымкомпонентом в липидном экстракте. Присутствие в смеси различныхструктурныхтиповтрегалолипидов,другихсоединенийлипиднойприроды и избытка н-алкана, используемого в качестве субстрата, ещеусложняет процесс очистки. Для оптимизации метода очистки целевыхтрегалолипидовколоночнойхроматографиейбылапредложенапредварительная стадия флэш-хроматографии для удаления избыткауглеводородов гексаном перед колоночной хроматографией [16].1.3.3 Определение структуры трегалолипидовИдентификация структуры трегалолипидов может быть проведена сиспользованием комплекса методов, некоторые из которых основаны наизучении структуры самой молекулы, а в других необходимо разрушитьмолекулу на составные компоненты (углеводную часть, жирные кислоты ит.д.) (табл.
5).Масс-спектрометрия и С13-ЯМР является наилучшими методами дляструктурной характеристики интактных молекул. Анализ полного массспектра трегалолипидов позволяет определить молекулярную массу49присутствующих гликолипидных биосурфактантов [27]. Для определенияструктуры используют метод тандемной масс-спектрометрии.изучениягликолипидовпредложеноиспользоватьметодыДлямасс-спектрометрии с бомбардировкой ускоренными атомами (FAB/MS) [55], сионизацией электрораспылением (ESI-MS) [63, 23, 56, 26] и матричноактивированнойлазернойдесорбцией/ионизацией(MALDI)[154].Наиболее используемый метода – масс-спектрометрия с ионизациейэлектрораспылением. Однако в этом методе при изучении гликолипидовприменяют режим положительной ионизации, который может осложнитьинтерпретацию результатов из-за наличия как протонированных ионов, таки натриевых или калиевых аддуктов.
Поэтому ESI-MS в режимеотрицательных ионов может быть лучшей альтернативой, что былопродемонстрировано в недавнем исследовании с использованием ВЭЖХМС [25].ЯМР можно также использовать для характеристики интактныхтрегалолипидов, либо после их гидролиза. ЯМР-анализ полной молекулыотносительно трудно интерпретировать, поэтому анализ трегалозной частиявляется более предпочтительным, предоставляя информацию, котораяпомогает охарактеризовать положение, в котором жирные кислотыприсоединяются к углеводной структуре [61, 62, 63, 56] .Газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектором(ГХ/МС) широко используется для характеристики остатков жирныхкислот, входящих в состав трегалолипидов.
После преэтерификации сметанолом липидная часть трегалолипидов превращается в метиловыеэфиры жирных кислот, что обеспечивает возможности их идентификацииметодом ГХ или ГХ/МС. Жирнокислотный состав трегалолипидов важендля подтверждения структуры трегалолипидов [65].50Таблица 5. Методы, используемые в определении структуры трегалолипидовМикроорганизмыпродуцентыRhodococcussp.H13-ARhodococcussp.H13-AR.wratislavientis BN38R.opacus 1CPБиосурфактантыТСХВЭЖХгликолипиды++гликолипиды+тетраэфирытрегалозыдимиколаттрегалозысукцинилтрегалолипидытрегалолипидыRhodococcussp. SD-74Rhodococcussp.
PML026R. erythropolis тетраэфиры51T7трегалозыTsukamurella трегалолипидыЯМРГХ/МСЖХ/МСMALDITOF/MSИКФурьеВЭЖХМСИсточник[60]+[151]++[63][56]++[26]++[27]+++МС/МС++[25][155]ТСХ – тонкослойная хроматография; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; ЯМР – ядерномагнитный резонанс; ГХ/МС- газовая хроматография с масс спектрометрическим детектором; ЖХ/МС – жидкостнаяхроматография с масс спектрометрическим детектором; MALDI-TOF/MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass-Spectrometry) –матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация – времяпролетный массанализатор; ИК Фурье – инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье; ВЭЖХ/МС – высокоэффективнаяжидкостная хроматография/ масс-спектрометрия; МС/МС – Тандемная масс-спектрометрия.ЗаключениеБиосурфактантыэмульгирующейобладаютактивностью,мицеллообразования,высокойнизкойнизкойповерхностнойкритическойтоксичностью.иконцентрациейОниявляютсябиоразлагаемыми и биосовместимыми, поэтому в последние годы находятширокоеприменениевразныхобластяхдеятельностичеловека.Микроорганизмы продуцируют целый ряд различных по природе иструктуреповерхностно-активныхвеществ(биосурфактантовибиоэмульгаторов).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
