Диссертация (1091621), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Уильямсен и Карлсон [134] аналогичный подход дляобнаружениябиосурфактантовиихпродуцентов:эффективнымипродуцентами биосурфактантов являются бактериями, которые способныснижать поверхностное натяжение среды больше чем на 20 мН/м, посравнению с дистиллированной водой.Асимметрический анализ формы капли (Axisymmetric drop shape analysisby profile -ADSA). Анализ формы капель является одним оптическимметодомопределенияповерхностного39натяжения.Дляскринингабиосурфактантов он впервые был применен [135]. Основной принципзаключается в том, что форма капель жидкости сильно зависит отповерхностного натяжения жидкости.
Капельки жидкостей с низкимповерхностным натяжением более склонны отклоняться от идеальносферической формы, чем капельки жидкостей с высоким поверхностнымнатяжением (рис.9).Рисунок 9. Форма сидячей капли с главными радиусами кривизны r1 и r2.Для анализа формы капель 100 мкл бактериальной суспензиипомещаютнаповерхностьтефлона.Профилькаплиопределяютконтурным монитором как функция времени (в течение 2 часов). Послеэтого поверхностное натяжение суспензии можно рассчитать по профилямкапель с помощью схемы решения, разработанной Ротенбергом ссоавторами [136].где ∆ρ – разность давлений на границе раздела, r1, r2 - главные радиусыкапли (рис.
8),σ – поверхностное натяжение, мН/мПоказано, что анализ формы капли может быть использован длямониторингабактерий-продуцентовбиосурфактантов[135].Преимущество метода - небольшое количество образца; Недостатки требуется специальная камера и программное обеспечение; расчетповерхностного натяжения довольно сложен. Кроме того, различныеобразцы не могут быть измерены параллельно.40Метод формы подвесной капли (The pedant drop shape technique)представляет собой оптический метод измерения межфазного натяжения.Капля жидкости может свисать с конца капилляра (рис. 10). Онапринимает равновесный профиль, который является уникальной функциейрадиуса трубки, межфазного натяжения, плотности и гравитационногополя.Рисунок 10.
Форма подвесной капли с экваториальным диаметром de инаименьшим диаметром dsПо Тадросу [137], межфазное натяжение рассчитывается последующему уравнению:∆2== () ()где Δρ - разность плотностей между двумя фазами, ds - экваториальныйдиаметр капли, de - наименьший диаметр висячей капли (рис. 10). Hявляется функцией ds и de.Модификацией этого метода является измерение в обратном режиме[138]. Небольшой объем воздуха вдували в жидкость и измеряли формувоздушного пузырька в жидкости. Недостатком метода подвесной формы41капли является то, что не могут выполняться измерения большогоколичества образцов одновременно.Косвенное измерение поверхностной/межфазной активности.Метод падения капели (Drop Collapse Assay).
Заин с соавт. В работе[139] авторы разработали метод коллапса капель. Этот метод основан надестабилизации жидкой капели биосурфактантами. Капели жидкости(культуральнаясреда,биосурфактантов)бесклеточныйнаносятнасупернатант,твердуюсуспензияповерхность,покрытуюгидрофобным субстратом. В случае отсутствия биосурфактантов полярныемолекулы воды отталкиваются от гидрофобной поверхности, и каплиостаются стабильными. Наоборот, в присутствии биосурфактантов каплирасширяются или даже разрушаются из-за уменьшения силы илимежфазногонатяженияповерхностью.биосурфактантовмеждуСтабильностьикаплейкапеликоррелируетсжидкостизависитигидрофобнойотповерхностнымконцентрацииимежфазнымнатяжением.ПодобныйанализбылописанПерссониМолин[140]сиспользованием поверхности стекла вместо поверхности, покрытойгидрофобным субстратом.
В работе [141] показано, что этот метод можетбыть использован как количественный для очищенных биосурфактантовпутем измерения размера капель с помощью микрометра. На этой основескрининг может выполниться автоматически в микропланшетах, при этомбесклеточный супернатант окрашивали для улучшения визуальногоэффекта, как описано в работе [142]. Метод падения капели выполняетсябыстро и легко на небольшом объеме образца, не требует специальногооборудования [143].
Кроме того, его можно проводить в микропланшетах[144]. Недостаток метода заключается в том, что в образце должноприсутствовать больше количество биосурфактантов, чтобы вызвалосьпадение капель жидкости на гидрофобных поверхностях.42Метод анализа с помощью микропланшетов. Поверхностнаяактивность биосурфактантов, продуцируемых разными бактериями, можетоцененакачественноспомощьюмикроплашетногоанализа,разработанного и запатентованного Во и Коттингем [145]. Метод основаннаизмененииоптическогоискажения,котороевызываетсябиосурфактантами в водной смеси.
Чистая вода в гидрофобной лункеимеетровнуюповерхность.Наличиебиосурфактантоввызываетсмачивание на краю лунок, и поверхность жидкости становится вогнутой ипринимает форму рассеивающейся линзы. При выполнении анализананосят 100мкл образца из каждого штамма (среда, супернатанта) в 96луночный планшет, который помещают на листе бумаги с сеткой. Наличиебиосурфактантов в образце отражается вогнутой поверхностью (рис. 11).Оптическое искажение сетки обеспечивает качественный анализ приналичии биосурфактантов.
Преимущества метода включаются в простомбыстром выполнении; высокая чувствительность позволяет выполнятьанализ большого количества образцов одновременно, требуется небольшойобъем образца (100мкл). Кроме того, этот метод подходит дляавтоматизированного скрининга с высокой производительностью [138].Рисунок 11.
Микропланшеты (слева – наличие рамнолипида в смеси;справа – чистая вода) [132]43Анализ проницаемости. Метод разработан Maczek и коллеги [142] иподходит к скринингу биосурфактантов в среде. Метод основан навзаимодействии двух нерастворимых фаз, которое приводят к изменениюокраски. Для этого лунку микропланшета заполняют 150мкл гидрофобнойпасты, состоящей из смеси силикагеля с гидрофобным субстратом(углеводород, нефть, масло). Пасту покрывают 10мкл гидрофобногосубстрата. Затем образцы окрашивают добавлением 10мкл окраски к 90мклобразца.Приналичиибиосурфактантовгидрофильнаяжидкостьпрорывается через барьер гидрофобной пленки в пасту.
Силикагель входитв гидрофильную фазу, а верхняя фаза будет меняться от красного добелого в течение 15 минут (рис. 12).Рисунок 12. Вид сверху на 96-луночный планшет: от 1 до 5 – образцы, вкоторых присутствуют биосурфактанты: 2 - низкая концентрация; 1,3,4 средняя концентрация; 5 - высокая концентрация; 6- отрицательныйконтроль [142].Описываемый эффект основан на том, что силикагель поступает вгидрофильную фазу из гидрофобной пасты гораздо быстрее, еслиприсутствуют биосурфактанты. Образцы, в которых нет биосурфактантов,становится мутным, но остается красным. Это простой метод длякачественного скрининга большого количества образцов. Он можетприменяться в качестве метода скрининга с высокой производительностьюАнализразбрасываниянефти(Oilspreadingassay).Анализразбрасывания нефти был разработан [146].
В чашку Петри помещают 40млдистиллированнойгидрофобнымслоемводы,наповерхности(10млсырой44нефти).которойДляпокрываетобнаружениябиосурфактантов, аккуратно наносят 10мкл образца в центр гидрофобногослоя. В наличии биосурфактантов, нефть вытесняется и образуетсяочищающая зона (рис. 13), диаметр которой на поверхности нефтикоррелируетсактивностьюбиосурфактантов,такженазываемойактивностью вытеснения нефти. Для чистого биосурфактанта приведеналинейная корреляция между количеством биосурфактанта и диаметромзоны вытеснения.Рисунок 13.
Тест по вытеснению нефти на присутствие биосурфактантов(справа) [147]Метод вытеснения нефти выполняется быстро и легко, не требуетспециального оборудования и небольшого объема образца [143]. Он можетприменяться как при низкой активности биосурфактантов, так и принизкой их концентрации. Плаза и др. [143] и Юсеф с соавторами [148]продемонстрировали, что метод вытеснения нефти является надежным дляобнаружения биосурфактантов, продуцируемых разнымиштаммамибактерий.Определение эмульгирующей активности.Индексэмульгирования.Метод,основаннаспособностьбиосурфактантов эмульгировать двух нерастворимых жидкостей, былразработан Купером и Голденбергом [133].
Для определения индексаэмульгирования к воде добавляют гидрофобный субстрат (керосин,гексадекан или др.). Смесь интенсивно встряхивают в течение 2 минут.Через 24 часа измеряют высоту стабильного слоя эмульсии. Индекс45эмульгирования через 24 часа (E24) рассчитывается как отношение высотыслоя эмульсии и общей высоты жидкости.ИндексэмульгированияE24коррелируетсконцентрациейбиосурфактантов, но не коррелирует с их поверхностной активностью.Такой метод простой, можно применять для скрининга биосурфактантов,продуцируемых в среде бактериями.Гидрофобность клеточной поверхности.Взависимостиотмеханизмапоглощенияуглеводородовмикроорганизмы могут обладать высокой и/или низкой поверхностнойгидрофобностью.Какправило,какиемикроорганизмыпоглощать углеводороды путем прямоговысокуюгидрофобностьклеточнойспособныконтакта, демонстрируютповерхность.Гидрофобностьклеточной поверхности определяют по адгезии микроорганизмов куглеводородам или гидрофобной поверхности полистирола.Бактериальная адгезия к углеводородам (BATH).
Метод разработанРозенберг и др. [149]. Это простой фотометрический метод дляопределения гидрофобности клеточных поверхности. Метод основан настепени сцепления клеток с капельками жидких углеводородов. Промытыеклетки ресуспендируют в физраствор или воду, затем смешивают сопределенным объемом жидкого углеводорода (гексадекана, октана).Интенсивно встряхивают, суспензию оставляют в течение 10 минут прикомнатной температуре.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
