Диссертация (1091621), страница 2
Текст из файла (страница 2)
В ряде работпоказано,чтоприпониженныхтемпературахродококкимогутпродуцировать биосурфактанты, как при росте на жидких (керосине) [3],так и при росте на твердых углеводородных субстратах (тетрадекане [4] ин-гексадекане [5]). Однако, биосурфактанты, которые продуцируютродококки при пониженной температуре, не идентифицированы, и их рольв биодеградации гидрофобных субстратов при низких температурах покамало изучена.Бактерии Rhodococcus erythropolis X5 и Rhodococcus erythropolis S67входят в состав биопрепарата «МикроБак», разработанный для очисткинефтезагрязненных почв в интервале температур +4 – +30°С [6].
Ранеебыло показано, что эти бактерии продуцируют в культуральную средутрегалолипидные биосурфактанты при температуре около 25°С [7].4Однако, взаимосвязь между степенью биодеградации гидрофобныхсубстратов и продукцией биосурфактантов этими бактериями не выявлена,тем более при пониженной температуре.Цель работыОпределить структуру и свойства биосурфактантов, продуцируемыхбактериями R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 при 10оС, и обосноватьпотенциал применения биосурфактантов для утилизации углеводородов напримере н-гексадеканаЗадачи исследования1.Наосновесравнительногоанализафизико-химическихпоказателей культуральной среды при температурах культивирования 26оСи 10оС (поверхностное натяжение, содержание сахаров), свойстваклеточной поверхности и роста клеток на н-гексадекане выявить влияниетемпературы на продукцию биосурфактантов родококками и адгезиюклеток бактерий к гидрофобному субстрату.2.
Определить общее содержание и жирнокислотный составвнеклеточных и клеточных липидов бактерий при росте на н-гексадеканепри 26оС и 10оС.3. Выяснить особенности ультраструктурной организации клетокродококков, выращенных на н-гексадекане при пониженной температуре.4. Определить химическую структуру и физико-химические свойстваосновного компонента внеклеточных гликолипидных биосурфактантов,продуцируемых родококками при 10оС.5.Длявыявлениявозможностиувеличенияэффективностибиоремедиации нефтезагрязненных территорий провести сравнительныйанализ результатов биодеградации н-гексадекана родококками придополнительном внесении в систему выделенного биосурфактанта.5Научная новизна работыВпервыепоказано,чтокачественныйсоставпродуцируемыхродококками биосурфактантов при росте на гексадекане в условияхпониженной температуры 10°С соответствует составу биосурфактантов,продуцируемых при 26°С.
Это означает, что важную роль в процессепотребления гидрофобных субстратов бактериями-нефтедеструкторамииграютгликолипидныебиосурфактанты,которыеспособствуютдоступности для микроорганизмов н-гексадекана, как в жидком, так и втвердом состоянии при пониженной температуре.Выявлена общая тенденция снижения гидрофобности клеточнойповерхности при увеличении содержания гликолипидов, продуцируемыхбактериями в культуральную среду, и подтверждена научная гипотеза обадаптации родококков к росту на гидрофобных субстратах путемперераспределениябиосурфактантовмеждусредойиклеточнойповерхностью.Впервые выделены и идентифицированы главные компонентыгликолипидов, которые продуцируют нефтеокисляющие бактерии родаRhodococcus при пониженной температуре (10оС).
Эти соединенияпредставляют собой смесь изомерных гомологов: 2,3,4-деканоил-октаноилсукцинил-2'-деканоилтрегалозы;деканоилтрегалозы;2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-октаноилтрегалозы;2,3,4-дидеканоил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы.Впервые установлено, что родококки при росте на гексадеканеформируют мультимембранные структуры (ММС), которые напоминаютламеллярные внутримембранные структуры.
Эти структуры связаны снакоплениями гидрофобных веществ в виде включений внутри клетки, чтоуказывает на их роль в транспорте и первичной трансформациигексадекана до гексадекановой кислоты.6Теоретическая и практическая значимостьДаннаяработарасширяетпредставленияграмположительных бактерий родабиодеградациигидрофобныхR. erythropolisсубстратов.сукцинилтрегалолипидыдеканоилтрегалозы;биосурфактантахи ихRhodococcusвыделяетX5оПоказано,вучастиичтовштаммкультуральнуюсреду(2,3,4-деканоил-октаноил-сукцинил-2'2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-деканоилтрегалозы;2,3,4-дидеканоил-2,3,4-диоктаноил-сукцинил-2'-октаноилтрегалозы;сукцинил-2'-деканоилтрегалозы) с высоким выходом и может служитьпродуцентом трегалолипидных биосурфактантов.
Физико-химическиехарактеристикисукцинилтрегалолипидовсвидетельствуютобихэффективности как биосурфактантов, что определяет дальнейшие широкиевозможности их применения. Обоснована целесообразность использованияштаммов R. erythropolis X5 и R. erythropolis S67 в биопрепаратах дляочистки нефтезагрязненных территорий в условиях холодного климата, втом числе за счет их способности продуцировать сукцинилтрегалолипиды.Выявленные закономерности функционирования микроорганизмов приучастии биосурфактантов в процессе биодеградации гексадекана припониженнойтемпературеформируютразработкибиопрепаратовитеоретическуюбиотехнологийосновудлядляочисткинефтезагрязненных территорий в условиях холодного климата.Апробация работы. Результаты работы были доложены намеждународном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективыразвития»(Москва,конференции(Москва,2319–21февраля«Микробное разнообразиеноября2016);2017г.);-IVмеждународнойресурсныйНаучно-практическойпотенциал»конференции«Биотехнология: наука и практика» (Крым, Ялта 2014, 2015, 2016); IIПущинской школе-конференции "Биохимия, физиология и биосфернаяроль микроорганизмов" (Пущино, 07–11 декабря 2015); Всероссийской7конференциисэлементаминаучнойшколыдлямолодежи«Экотоксикология» (Тула, 2014, 2015 и 2016г); IX Региональноймолодѐжной научно-практической конференции ТулГУ (Тула, 14октября 2015).Результаты исследований по теме диссертации представлены в 3-хстатьях в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемыхжурналов и изданий ВАК, в 5-и статьях в журналах (РИНЦ), и 9сообщениях в форме тезисов и материалов конференций.8ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР1.1Поверхностно-активныевещества,продуцируемыемикроорганизмамиПоверхностно-активныевещества(ПАВ)представляютсобойамфифильные соединения с гидрофильными и гидрофобными частями,которые способны снижать поверхностное и межфазное натяжение награнице раздела фаз "жидкость-воздух", "жидкость-жидкость".
Основуклассификациисоставляетхимическаяструктурасоединений,чтопозволяет выделить четыре основных класса ПАВ: анионные, катионные,амфотерные и неионогенные. По молекулярной массе, ПАВ делят нанизкомолекулярные и высокомолекулярные. Основной количественнойхарактеристикойПАВявляетсякритическаяконцентрациямицеллообразования (ККМ), при которой формируются молекулярныеагрегаты или мицеллы, и соответствуют точке, при которой поверхностноенатяжение ПАВ достигает минимального значения. Известно, чтобольшинство синтетических ПАВ получают химическим синтезом изуглеводородов нефти.
Синтетические ПАВ проявляют токсичность и струдом разрушаются природными микроорганизмами [8].ЖивыеорганизмыспособныпродуцироватьПАВ,из-заихбиологического происхождения такие соединения получили названиебиоПАВ. Изучение биоПАВ началось еще в 60-х годах прошлого столетия,и интенсивно продолжается в последние время [9-11]. Такое вниманиеобусловлено тем, что биоПАВ находят применение в различных отрасляхпромышленности благодаря преимуществам перед синтетическими ПАВ.Они обладают низкой токсичностью; биоразлагаемостью; способностьюфункционировать в широких диапазонах рН, температуры и соленостисреды; высокой поверхностной активностью и могут быть получены9биотехнологически из промышленных отходов и побочных продуктовнефтепереработки [12] .Самыми эффективными продуцентами являются микроорганизмы.Они продуцируют биоПАВ с разнообразными химическими структурами.Гидрофобная часть этих веществ (неполярный “хвост”) наиболее частопредставлена остатками жирных кислот, а гидрофильная (полярная“головка”) – остатками фосфорной кислоты, карбоксильными группамиприродныхкислот,аминокислотами,пептидами,моно-,ди-,илиполисахаридами и др.
БиоПАВ характеризуются высокой поверхностной иэмульгирующей активностью.БиоПАВ разделяют на два основных класса [13]: низкомолекулярныесоединения,называемыебиосурфактантами(липопептиды,гликолипиды, пептиды), и высокомолекулярные полимеры (полисахариды,протеины,липополисахариды,биополимеров),которыелипопротеиныназываютсяиликомплексбиоэмульсанами[14]этихилибиоэмульгаторами [15].
В первую группу входят молекулы, которыемогут эффективно снижать поверхностное и межфазное натяжение, а ковторой относятся амфифильные и полифильные полимеры, обладающиевысокой и стабильной эмульгирующей активностью в системе «масловода», но не высокой поверхностной активностью [16].По своему строению биоПАВ классифицируются на гликолипиды(рамнолипиды,липопротеины;трегалолипиды,жирныесофоролипиды);кислоты;липопеплидыфосфолипиды;иполимерныесурфактанты; связанные биосурфактанты [12]. Для микроорганизмовразных родов характерны различные типы биоПАВ (табл.1).10Таблица 1.
Типы биосурфактантов и их продуцентыНизкомолекулярные биоПАВТипы биоПАВГликолипидыРамнолипидыТрегалолипидыСофоролипидыМикроорганизмы - продуцентыPseudomonas [17-20]; Acinetobacter [21];Rhodococcus [22-27]; Tsukamurella [28].Candida [29] [30, 31];Маннозилэритроллипиды (МЭЛ) –ЛипопептидыPseudozyma [32];Bacillus [33]; Candida [34]; Acinetobacter[35]; Rhodococcus [36]; Arthrobacter [37]ДругиеВысокомолекулярныебиоПАВЖирные кислотыТриглицеридыФлаволипидыФосфолипидыБиоэмульгаторыГликопротеины:АласанЭмульсанПолисахаридылипопротеиныНаиболееCorynebacterium lepus [38]Norcadia erythropolis [39]Flavobacterium [40]Klebsiella pneumoniae [41], Pseudomonas[42]Acinetobacter [43-45]Acinetobacter [14]и Acinetobacter [46]распространеннымииизученнымимикробнымисурфактантами являются гликолипиды и липопептиды.Липопептиды представляют собой циклические молекулы, такие какантрофактин,интурин,сурфактин,продуцируемыебактериямиArthrobacter sp.
MIS38 (рис.1) [47]; лихенизин А – продуцент Bacilluslicheniformis [48]; вискозин – Pseudomonas fluorescens [49]. Циклическиелипопептиды, такие как сурфактин, способны очень сильно снижатьповерхностное натяжение воды. Сурфактин бактерий Bacillus subtilisявляется одним из наиболее эффективных биосурфактантов. Он может11снижать поверхностное натяжение воды с 72 до 27мН/м при содержании25мг/л [50].Рисунок 1. Структуры липопептидных биосурфактантов бактерийArthrobacter sp.
MIS38 [47]Гликолипиды часто представляют собой моно- или дисахариды,ацилированные жирными кислотами. К ним относятся рамнолипиды,софоролипиды, трегалолипиды, маннозилэритроллипиды (МЭЛ) [10](рис.2).Рисунок 2. Структура основных гликолипидных биосурфактантов,продуцируемых бактериями12Среди гликолипидных биосурфактантов, наиболее изученнымиявляются рамнолипиды бактерий Pseudomonas и софоролипиды дрожжей.Они производятся в значительных количествах и коммерчески доступны.Трегалолипидныебиосурфактантыизвестны,трегалозомиколаты,какMycobacteriumтрегалолипидыtuberculosisменееизучены.синтезируемыененаиболеебактериямипалочками).(туберкулезнымипродуцируютсяОнитолькоОднако,патогеннымимикроорганизмами, но и актинобактериями родов Rhodococcus, Norcadia,Tsukamurella при росте на гидрофобных субстратах.Трегалолипидные1.2.биосурфактантыбактерий-нефтедеструкторов рода Rhodococcus1.2.1 Структурное разнообразие трегалолипидов, продуцируемыхродококкамиВпервые трегалолипиды были выделены из липидов бактерии излипидов Mycobacterium tuberculosis [51].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
