Диссертация (Особенности врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙМЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И.ПИРОГОВА»МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИНа правах рукописиБрагвадзе Белла ГелаевнаОСОБЕННОСТИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ СБРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:доктор медицинских наук,профессор Л.В. Ганковскаядоктор медицинских наук,профессор, академик РАНЛ.С. Намазова-БарановаМосква – 2018  ОглавлениеВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 5Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................ 131.1 Клинические особенности бронхиальной астмы у детей .................................. 131.2 Иммунопатогенез бронхиальной астмы. Роль врожденного иммунитета впатогенезе бронхиальной астмы ...............................................................................

201.2.1Дисфункцияэпителиальногобарьерареспираторноготрактаприбронхиальной астме ................................................................................................... 221.2.2 Двойственная роль Toll-подобных рецепторов в патогенезе бронхиальнойастмы… ....................................................................................................................... 251.2.3 Характеристика противомикробного пептида β-дефенсина-1 ........................

301.2.4 Эпителиальные цитокины IL-33 и TSLP .......................................................... 331.2.5 Роль трансформирующего фактора роста β в воспалении при бронхиальнойастме............................................................................................................................ 361.2.6 Интерферон III типа (IL-28λ), участие в патогенезе бронхиальной астмы .... 37Глава 2.

Материалы и методы ................................................................................... 432.1 Клиническая характеристика исследуемых групп ............................................. 432.2 Общая схема исследования................................................................................. 452.3 Получение биологического материала................................................................ 472.3.1 Получение лейкоцитов периферической крови ............................................... 482.4 Определение уровня экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9, HBD1,IL-28Bметодом ПЦР в режиме реального времени .............................................................

492.4.1 Выделение РНК из соскобов со слизистой оболочки полости носа илейкоцитов периферической крови ........................................................................... 492.4.2 Реакция обратной транскрипции (ОТ) ............................................................. 512      2.4.3 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ......................... 522.5 Оценка экспрессии TLR2, TLR4 на лейкоцитах периферической кровиметодом проточной цитометрии ............................................................................... 572.6Определениецитокинов(IL-28B,IL-33,IL-4,TSLP)методомиммуноферментного анализа ....................................................................................

592.7Определениепро-ипротивоспалительныхцитокиновметодоммультиплексного иммунофлюоресцентного анализа в назальных смывах ............ 632.8 Статистическая обработка результатов .............................................................. 63Глава 3. Результаты и обсуждение ............................................................................ 643.1 Особенности экспрессия генов TLR2, TLR4, TLR9 и HBD 1 в клеткахслизистой оболочки полости носа у детей с бронхиальной астмой различнойстепени тяжести ......................................................................................................... 643.2.

Анализ экспрессии TLR2, TLR4, TLR9 в лейкоцитах детей с бронхиальнойастмой ......................................................................................................................... 713.2.1 Особенности экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9 в лейкоцитах у детей сбронхиальной астмой ................................................................................................. 713.2.2 Изменение экспрессии мембранных рецепторов (TLR2 и TLR4) в лейкоцитаху детей с бронхиальной астмой .................................................................................

733.3 Анализ содержания эпителиальных цитокинов IL-33 и TSLP в назальныхсмывах и сыворотке крови детей с бронхиальной астмой....................................... 763.4 Изменение спектра про- и противовоспалительных цитокинов у детей сбронхиальной астмой ................................................................................................. 803.5. Изменение экспрессии противовирусного цитокина IL-28B на уровне гена имолекулы белка у детей с бронхиальной астмой ..................................................... 86Заключение ................................................................................................................. 90ВЫВОДЫ ...................................................................................................................

983      Практические рекомендации ................................................................................... 100СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...................................................................................... 101СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 1044      ВВЕДЕНИЕАктуальностьБронхиальная астма (БА) – это хроническое воспалительное заболеваниедыхательных путей, которое сопровождается обструкцией и гиперреактивностьюбронхов [25].

В настоящее время во всем мире насчитывается более 300 млнпациентов с БА [35]. Более того, БА является одним из самых распространенныххронических детских заболеваний и обуславливает значительное снижениекачества жизни пациентов и членов их семей [157].На современном этапе исследования БА сконцентрированы на изучении еепатогенеза, выделению патогенетических и клинических фенотипов БА с цельюразработки новых методов диагностики и лечения. IgE-опосредованномумеханизму формирования атопического фенотипа отводят ключевую роль впатогенезе БА [50]. При этом, в последние время особое внимание уделяютисследованию механизмов врождённого иммунитета.

Это обусловлено важнойрольюврождённогоиммунитетавразвитиихроническоговоспаления,являющегося неотъемлемым компонентом формирования БА. А также темфактом, что нарушение механизмов защиты врожденного иммунитета упациентов с БА способствуют развитию острых респираторных инфекции (ОРИ).Долгоевремярассматривалиэпителийтолькокакслизистойоболочкимеханическийбарьер,дыхательныхпутейзащищающийотнеблагоприятных факторов окружающей среды. В настоящее время ему отводятроль полноправного участника иммунных механизмов, выполняющего своюфункциюпутёмудаленияпатогеназасчётмукоцилиарногоклиренса,распознавания патогена Toll-подобными рецепторами (TLRs), секреции рядацитокинов и противомикробных пептидов [27, 59, 92, 118].Противомикробные пептиды β-дефенсины, продуцируемые эпителием,обладают бактерицидной активностью и предотвращают вторжение патогенов вслизистую оболочку респираторного тракта.

А реализация противовирусногоиммунитета клетками слизистой оболочки возможна благодаря продукции5      интерферонов (IFN), в частности IFN I и III типов. В последние годы исследуетсяроль интерлейкина 28 (IL-28B - IFN-λ3) как медиатора врождённого иммунитета впатогенезе вирусиндуцированной астмы [110].Кроме этого, эпителиальные клеткислизистой оболочки оказываютвыраженное влияние на характер активации дендритных клеток (ДК) идальнейшее формирование Th1- или Th2- типов иммунного ответа [80]. Этафункция реализуется вследствие синтеза IL-33, IL-25 и тимического стромальноголимфопоэтина (TSLP).

Эти цитокины играют важную роль в формированииаллергического типа воспаления, индуцируя продукцию иммуноглобулина Е(IgE).Болеетого,данныеэффекторныемолекулывыступаютвролихемоаттрактантов для эозинофилов и базофилов, которые непосредственновлияют на гладкомышечные и слизистые клетки респираторного тракта [110,137].

Данный процесс обуславливает развитие гиперреактивности дыхательныхпутей и хронической воспалительной реакции.Синтезэффекторныхмолекулицитокиновинициируетсяпаттернраспознающими рецепторами, среди них ключевыми рецепторамиявляются TLRs [37]. Наиболее информативным представляется изучениерецепторов TLR2, TLR4 и TLR9, т.к. они распознают широкий спектр лигандовбактериальной и вирусной природы.

Так, TLR2 распознает Pathogen-associatedmolecular pattern (PAMP) грамположительных бактерий, микоплазм и дрожжей, аTLR4 активируется при воздействии грамотрицательных бактерий, белковтеплового шока, а также аллергенов. В свою очередь, рецептор TLR9 распознаетучастки бактериальной и вирусной ДНК, обогащённые неметилированными CpG(цитозин-фосфат-гуанин)-последовательностями.рецепторактивируетсяврезультатеТакимвоздействияобразом,патогеновнеданныйтолькобактериальной, но и вирусной природы [134].Diogenes S. Ferreira с соавторами, используя иммуногистохимический метод,обнаружилигиперэкспрессиюTLR2,TLR3иTLR4наповерхностиэпителиальных клеткок слизистых оболочек дыхательных респираторного трактау пациентов с тяжелой БА [62].6      В последние годы показано, что аллергены, а также аллергены, загрязненныебактериальным липополисахаридами (ЛПС), активируют TLR2- и TLR4опосредованные механизмы, направляющие дифференцировку Т-лимфоцитов поTh2 пути [136, 156].В связи с этим комплексный подход в изучении TLRs и эффекторныхмолекул: β-дефенсина 1 (HBD1), IL-28B, про- и противовоспалительныхцитокинов, представляется реальным шагом в определении роли врожденногоиммунитета в патогенезе БА.