Диссертация (Клинико-иммунологические особенности воспалительных заболеваний придатков матки гонорейной этиологии), страница 7

Для37гомеостаза использовали моно- и биполярную коагуляцию.Затем проводили детальный осмотр органов малого таза и брюшнойполости, визуализировали анатомические взаимоотношения, определяли характер,локализацию воспалительного процесса и его распространение на париетальнуюбрюшину, органы малого таза, глубину воспалительного процесса, образованиеспаек. Объективную оценку степени воспалительного процесса в малом тазупроводили по критериям, разработанным А.Н.

Стрижаковым, Н.М. Подзолковой(1996).Учитывались отечность, гиперемия маточных труб, наличие фибриновыхналожений на фаллопиевых трубах, стенках кишки и на брюшине, наличиеспаечного процесса в этих областях, количество и характер патологическоговыпота.В ходе операции производили устранение патологического процесса(эвакуацию патологического содержимого, разделение спаек, санацию брюшнойполости растворами антисептиков с последующим ее дренированием). Впослеоперационномпериодепациенткампроводилиантибактериальнуюдезинтоксикационную терапию с учетом чувствительности флоры.7. ЛапаротомияОперативное вмешательство лапаротомическим доступом выполнялось потрадиционной методике под эндотрахеальным наркозом. При выполнениилапаротомии в экстренном порядке, применялся нижнесрединный разрез и вмомент операции проводилось удаление воспалительного очага, пораженногооргана, санация брюшной полости.2.3.

Иммунологическое исследование (определение экспрессии генов TLR2 иHBD1 в эпителиальных клетках)Материал слизистой цервикального канала получали во время осмотра припомощи зеркал с помощью цервикальной цитощѐтки типа D. Содержимоематочных труб получали в ходе оперативного вмешательства в результателапароскопии.

Из материала выделяли мРНК и проводили реакцию обратной38транскрипции. Затем методом ПЦР в режиме реального времени определяликоличество копий ДНК.2.3.1. Выделение РНК из клинического материалаПроведение выделения РНК, а также реакции обратной транскрипции, ПЦР-РВ и электофорез осуществляли на базе ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАН (директор института – академик РАН, д.м.н., профессор В.В.Зверев).Выделение РНК проводили по стандартным протоколам. Для выделенияРНКиспользовалииспользовалиметоднаборыкисло-фенольной«Рибо-сорб»(ФГУНэкстракцииЦНИИЭ[206],атакжеРоспотребнадзора,АмплиСенс, РФ).

Выделения РНК проводили строго по инструкции фирмыпроизводителя с добавлением RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Германия).Полученные образцы нуклеиновых кислот хранили при температуре минус 70 ºС.Выделенную РНК использовали как матрицу для синтеза кДНК в реакцииобратной транскрипции с применением набора Реверта (ИЛС, РФ).2.3.2. Реакция обратной транскрипцииРеакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили согласно протоколам [77].Реакционная смесь при синтезе кДНК (общий объем 25 мкл) содержала четыреосновных dNTP («Синтол», РФ) в концентрации 1mM каждого, 10 нмолей randomгексамеров («Синтол», РФ), 10 нмолей праймера-затравки («Синтол», РФ), матрицу и 100 ед.

ревертазы M-MLV («Синтол», РФ). При составлении реакционнойсмеси использовали 5х буфер для обратной транскрипции. Полученную кДНКхранили при минус 70ºС.Праймеры для последовательностей исследуемых мРНК были подобраны спомощью программы Vector NTI 8,0 и синтезированы фирмой «Синтол» (РФ).Для обратной транскрипции β-актина использовали Random-праймеры (шестичленные олигонуклеотиды со случайной последовательностью оснований).2.3.3 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времениПраймеры и зонды для ПЦР-РВ были моделированы в компьютерной программе Vector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК исследуе-39мых генов (последовательности мРНК были взяты в базе GenBank) и синтезированы сотрудниками фирмы «Синтол» (РФ).

Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase («СибЭнзим», РФ), Hot StartTaq DNA Polymerase (Qiagen, Германия), TaqBead HotStart Polymerase (Promega,США), а также "«Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)» («Синтол», РФ). Для определения экспрессии гена актина помимо имеющейся системы, использовали «Наборреактивов для обнаружения и определения кДНК β-актина человека» («Синтол»,РФ).

Все действия по постановке реакции проводились согласно рекомендациямфирмы-производителя. При постановке ПЦР-РВ без использования коммерческихнаборов реакцию проводили в 25 мкл смеси, которая содержала 2 ед. Hot Stat Taqpol («СибЭнзим», РФ), 2,5 мкл 10х буфера, 2,5 мкл MgCl2, которые прилагались кферменту, 2,5 мкл dNTP («СибЭнзим», РФ), прямого и обратного праймеров, зонда TaqMan и 2 – 4 мкл матрицы [165].Послеприготовленияреакционныхсмесейпробиркипомещаливамплификатор АНК–32 для ПЦР-РВ ДТ-96 («ДНК-Технологии», РФ) с заданнойпрограммой инкубации:Режим – циклический; 50ºС – 2 мин.95ºС – 10 мин.60ºС – 50 сек.40 циклов95ºС – 15 сек.По разведениям положительных контрольных образцов (стандартов) сизвестной концентрацией (брали 102 – 108 кол-во копий) строили калибровочнуюкривую, по которой рассчитывали число копий кДНК в исследуемых образцах(рис.

2.1).40Рисунок. 2.1. Построение калибровочного графикаДля стандартизации результатов рассчитанное по калибровочной кривойчисло копий пересчитывали на 106 (или 103) копий β-актина. Программноеобеспечение прибора ДТ-96 позволяет получить данные по пороговому циклу.Для образцов получали значение логарифма числа копий определяемого гена ичисла копий гена -актина. Количество копий -актина использовалось длястандартизации результатов. То есть количество копий определяемого генапересчитывалось относительно копий гена -актина, который является геном«домашнего хозяйства» и экспрессируется постоянно и во всех клеткахорганизма. Для контроля использовали две пробы: реакционная смесь + вода (К) иреакционная смесь + отрицательный контроль реакции обратной транскрипции(RTK-).Для определения концентрации HNP1-3 в сыворотке крови больных схронической патологией придатков матки использовали наборы Hy CultBiotechnology, Нидерланды.2.4.

Статистическая обработка результатовПолученные данные подвергались статистической обработке при помощипрограммы «SPSS» (IBM, США), «Epi info» (USA.gov, США).41Количественные показатели представляли в виде: М ± Р, где M – среднеезначение, а P – доверительный интервал. Нормальность законов распределениячисловых показателей проверяли при помощи критерия Колмогорова – Смирнова.Достоверность различий количественных признаков проверяли при помощи Uкритерия Манна – Уитни (сравнения попарно независимых групп данных) икритерия Уилкоксона. Для выяснения значимости различий качественных иранговыхпризнаковиспользоваликритерийχ2(сравнениячастотныххарактеристик качественных признаков). Различия считали достоверными при p <0,05.Дизайн исследования1.Выявление возбудителей острых воспалительных заболеваний придатковматки.2.Выделение из обследованных группы пациенток с острыми воспалительны-ми заболеваниями придатков матки гонорейной этиологии.3.Оценка клинической картины заболевания, выявление типичных признаков.4.Изучение показателей системы врожденного иммунитета у пациенток с ост-рыми воспалительными заболеваниями придатков матки гонорейной этиологии.5.Изучение показателей системы врожденного иммунитета у пациенток схроническими воспалительными заболеваниями придатков матки, осложненнымитрубно-перитонеальным бесплодием.6.Оценка эффективности включения в комплекс лечения препарата «Супер-лимф» пациенткам с хроническими воспалительными заболеваниями придатковматки, осложненными трубно-перитонеальным бесплодием.42Глава 3Особенности течения острого воспалительного процесса гонорейнойэтиологии органов малого таза (собственные результаты)Причиной ВЗОМТ чаще всего является восходящая инфекция из нижнихотделов полового тракта с развитием сальпингита, оофорита, тубоовариальныхабсцессов и пельвиоперитонита.

По данным Г.М. Савельевой [101], А.А. Евсеева[32] и других авторов основная роль принадлежит инфекциям, передающимсяполовым путѐм [4, 37, 46, 164]. Многие клиницисты также придерживаютсямнения, что основными возбудителями острых воспалительных заболеванийорганов малого таза, и прежде всего придатков матки, являются инфекции,передаваемые половым путѐм: Chlamyda trachomatis (30%) и Neisseria gonorrhaeae(50%) [6]. При этом представители нормальной флоры полового тракта такжеимеют огромное значение в поддержании воспалительного процесса [139,156].Гонорея – инфекционное, передающееся половым путем заболевание,вызванное гонококком (Neisseria gonorrhoeae). По данным ВОЗ, заболеваниеежегодно регистрируется у 200 млн человек. В России после некоторогоснижения заболеваемости в 90-е годы ХХ столетия вновь отмечен рост числалюдей, заболевших гонореей, до 102,2 на 100 тыс.

населения [4]. Так, по даннымВОЗ (2000г.), на долю воспалительных заболеваний женских половых органов,вызванных гонорейной инфекцией, приходится 40 – 50% .У 80% женщин и 10% мужчин гонорея протекает бессимптомно [4].Ранее в литературе описывали симптомы характерные для восходящейгонореи: наличие кровяных выделений из половых путей, двустороннеепоражение придатков матки, связь заболевания с менструацией, родами,абортами, внутриматочными вмешательствами; быстрый эффект от проводимойтерапии: уменьшение количества лейкоцитов в крови и снижение температурытела при повышенной СОЭ [5, 6].В настоящее время на практике мы редко встречаем подтвержденнуюгонорейную инфекцию при остром воспалении придатков матки, что послужилооснованием изложить клинические признаки острого воспалительного процесса43матки, показать этиологическиую структуру и изучить состояние врожденногоиммунитета.3.1 Клиническая характеристика женщин, подвергшихся оперативномулечению в связи с гнойно-воспалительными заболеваниями придатковматки3.1.1 Выявление возбудителей острого воспалительного заболеванияпридатков маткиНами проанализирована флора цервикального канала, маточных труб, атакже содержимого малого таза и брюшной полости у 108 пациенток.При бактериологическом исследовании у этих пациенток из цервикальногоканала чаще всего определялась кокковая флора в 56 наблюдениях, что составляет52,0%, или смешанная флора – палочковая с преобладанием кокковой в 40наблюдениях (37,0%).

В 12 наблюдениях (11,0%) микроскопия позволялазафиксировать псевдомицелий дрожжеподобного грибка (рис. 3.1).Рисунок 3.1. Микрофлора, выявленная после взятия мазков из цервикального каналаДля выявления и уточнения этиологии патологического процессабыло проведено также бактериологическое исследование содержимого брюшнойполости во время лапароскопии.Среди возбудителей воспалительного процесса были выявлены: S.epidermalis – в 5-ти наблюдениях (4,6%); S.аureus – в 3-х (2,8%); E.

сoli – в 2 - х (1,9%); Microccocus luteus выявлен в 2 –х случаях (1,9%).44Ни в одном наблюдении также не удалось выявить роста гонококков.Обязательным условием этого исследования являлось определение степеничувствительностивыявленныхмикроорганизмовкантибактериальнымпрепаратам. Было выявлено S. epidermalis, S.aureus наиболее чувствительны кцефотаксину,цефтриаксону иципрофлоксацину.ЧувствительностьE.cоliопределена к ципрофлоксацину и к аминогликозидным препаратам (амикацин,гентамицин).

Microccocus luteus наиболее чувствителен к амоксициллину. Послеполучения данных о чувствительности корректировалась антибактериальнаятерапия.Всем пациенткам во время лапароскопии проводили забор содержимогомалого таза для выявления инфекций методом ПЦР, показавший наличие:Neisseria gonorrhoeae – у 6 (5,6%), Chlamydia trachomatis – в 9 (8,3%) случаях,Mycoplasma genitaliu – не выявлено, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum,Herpes simplex, Trichomonas vaginalis – не выявлено, Mycobacterium tuberculosis –у 2 (1,9%).Скринирование на те же возбудители проводилось и в выделениях, взятыхиз цервикального канала.