Диссертация (Особенности иммунитета у недоношенных новорожденных детей с респираторными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза), страница 11

Трое детей из 1б подгруппынаходились на искусственной вентиляции легких с первых суток жизни, дваребенка потребовали применения высокочастотной осцилляторной вентиляциилегких, что свидетельствует о тяжести их клинического состояния. К 3 суткамжизни на самостоятельное дыхание было переведено подавляющее большинстводетей (93,9%) из 1а подгруппы и лишь 7 детей (16,3%) из 1б подгруппы(Р<0,0001).

В подгруппе 1б выраженность дыхательных нарушений осталась напрежнем уровне у 13 детей (30%), улучшение состояния наблюдалось у 22новорожденных (51%), у 8 детей (19%) отмечено нарастание тяжестидыхательныхрасстройств.Дляпредупрежденияразвитияинфекционно-воспалительных заболеваний дети из 1 группы с первых суток жизни получали55антибактериальную терапию. После установления окончательного диагноза на 3сутки жизни прием антибиотиков новорожденными с ТТН и РДС был прекращен,у детей с врожденной пневмонией терапия была продолжена курсом 7-10 дней.Таким образом, малый гестационный возраст, низкие массо-ростовыепоказатели, морфо-функциональная незрелость систем органов у детей из даннойгруппы обусловливают тяжесть их состояния при рождении, что влечет за собойболее продолжительное пребывание в условияхмногократныхобследований.Незрелостьстационара, проведениедыхательнойсистемызачастуюобусловливает более продолжительное пребывание ребенка на инвазивнойдыхательной поддержке, что может быть причиной вентилятор-ассоциированныхинфекционно-воспалительныхзаболеваний.Применениеантибактериальныхпрепаратов препятствует развитию нормальной микрофлоры кишечника и, какследствие, нарушению становления иммунной системы слизистой оболочкижелудочно-кишечноготрактаипроцессовфизиологическойадаптацииноворожденных.3.2.

Особенности иммунитета у новорожденных детей различногогестационного возрастаИммунная система новорожденных имеет ряд существенных отличий отиммунной системы взрослых людей, что обусловливает их повышеннуювосприимчивость к возбудителям инфекционно-воспалительных заболеваний.Однако результаты исследования особенностей иммунного ответа детей присвоевременном и преждевременном рождении противоречивы. В связи с этим,нами было проведено комплексное иммунологическое обследование доношенныхи недоношенных новорожденных без признаков инфекционно-воспалительныхзаболеваний,включающееоценкуфенотипическихособенностейклетокиммунной системы, функциональной активности фагоцитов, определениесодержания цитокинов и иммуноглобулинов в плазме крови.563.2.1. Фенотипическая характеристика фагоцитов пуповинной кровиУстановлено, что относительное и абсолютное содержание нейтрофильныхгранулоцитов в пуповинной крови недоношенных детей статистически значимониже, чем у здоровых доношенных новорожденных.

В то же время, не быловыявлено статистически значимых различий в содержании лейкоцитов (х109/л) впуповинной крови: 14,1±4,67 в группе здоровых доношенных новорожденных и13,2±6,45 у недоношенных детей.Определение экспрессии поверхностных молекул проводили методомпроточнойцитометриимоноклональныхантител,сприменениемсогласнофлуоресцентностандартномупротоколу.меченныхРезультатыисследования фенотипа нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов представленыв табл. 3.57Таблица 3.Экспрессия дифференцировочных маркеров на фагоцитах кровиисследуемых групп, M±SDПодгруппаПоказательобщее содержаниеCD1141а, n=16CD95РНейтрофильные гранулоциты%41,7±17,2648,6±6,41<0,001х109/л6,1±5,856,9±2,650,001%95,5±3,0591,4±4,830,03121,0±24,2864,3±12,46<0,001%74,6±9,0671,4±12,730,57MFI31,5±6,7828,5±5,550,30%89,8±9,5491,6±5,470,52MFI37,5±5,5938,7±6,400,56MFICD116Группа 2,n=16Моноцитыобщее содержаниеCD114CD116CD95%10,3±2,5910,4±1,690,87х109/л1,3±0,531,5±0,550,33%95,1±4,3773,5±19,240,001MFI83,8±17,4742,0±9,90<0,001%97,0±1,5691,9±7,680,03MFI67,4±13,2263,1±11,730,44%90,7±12,6982,4±11,500,06MFI39,2±8,9241,4±7,230,44Примечание: подгруппа 1а – недоношенные новорожденные без признаковинфекционно-воспалительных заболеваний, группа 2 – здоровые доношенныедетиСодержание фагоцитов, несущих поверхностную молекулу Fas/APO(CD95),являющуюсямаркеромконечногоразличалось в исследуемых группах (Р>0,05).этападифференцировки,не58В пуповинной крови недоношенных новорожденных детей по сравнению сдоношенными выявляется значимо более высокое содержание фагоцитов,экспрессирующих рецептор к G-CSF (CD114).

Интенсивность экспрессии данноймолекулы на моноцитах также выше в 1а подгруппе, чем в группе 2. Экспрессияна фагоцитах рецептора к GM-CSF (CD116) существенно не различалась висследуемых группах (Р>0,05). Эффект G-CSF и GM-CSF осуществляетсяпосредством связывания с соответствующими рецепторами на поверхностимиелоидных клеток. Исходя из имеющихся данных о значительном сниженииинтенсивностиэкспрессииG-CSFRнамиелоидныхклеткахприихдифференцировке [84], можно предположить, что более высокое содержаниенейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих рецептор к данному ростовомуфактору, обусловлено незрелостью миелоидных иммунных клеток и их высокойпролиферативной активностью в группе недоношенных детей.Известно, что нейтрофильные гранулоциты и моноциты являются первойлинией иммунной защиты против возбудителей инфекционных заболеваний. Ониспособны быстро мигрировать к месту инвазии патогенов, поглощать их ипрезентировать антигены клеткам адаптивного иммунитета.

Распознаваниечужеродных микроорганизмов фагоцитами является второй после хемотаксисастадией фагоцитоза, реализация которой происходит, благодаря наличию наповерхности нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов патоген-распознающихрецепторов и рецепторов к опсонинам. Результаты оценки экспрессии TLR2,TLR4, FcγRI, FcγRIII и CR3 представлены на рис. 3.БИнтенсивностьфлуоресценции, MFI100806040200TLR2TLR4CD64ВСодержание клеток, %Подгруппа 1аCD16CD11bГруппа 2Г100806040200TLR2,TLR4CD64Подгруппа 1аCD16Группа 2CD11bИнтенсивностьфлуоресценции, MFIАСодержание клеток, %591000800600*4002000TLR2TLR4CD64Подгруппа 1аCD16CD11bГруппа 2Рисунок 3. Экспрессия патоген-распознающих рецепторов и рецепторов к опсонинам на нейтрофильныхгранулоцитах (А,Б) и моноцитах (В,Г).* - Р<0,05 по сравнению с группой 2, ** - Р<0,01 по сравнению с группой 260В пуповинной крови недоношенных новорожденных (подгруппа 1а) посравнению с доношенными детьми из второй группы была отмечена болеевысокая интенсивность экспрессии CD16 на нейтрофилах и низкая – CD11b нафагоцитах, что может иметь существенное значение в хемотаксическойактивности клеток и распознавании ими опсонизированных микроорганизмов.Выявлена прямая корреляционная зависимость между гестационнымвозрастом и содержанием моноцитов, экспрессирующих CD11b (r = 0,374 Р =0,035), интенсивностью его экспрессии (r = 0,369 Р = 0,038), интенсивностьюэкспрессии CD14 (r = 0,571 Р = 0,013) на моноцитах пуповинной крови.

Обратнаякорреляционная зависимость была обнаружена между гестационным возрастом исодержанием CD114+ моноцитов (r = – 0,614 Р = 0,0014), а также интенсивностьюего экспрессии (r = – 0,675 Р = 0,0014).Установлено, что в пуповинной крови недоношенных детей экспрессия(MFI) HLA-DR на моноцитах существенно выше, чем у здоровых доношенныхноворожденных: 240,5±118,69 и 163,8±61,72 соответственно (Р=0,03).Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что более высокоесодержание фагоцитов, экспрессирующих рецепторы к ростовым факторам, вкрови недоношенных детей может быть признаком незрелости миелоидныхклеток врожденного иммунитета и их высокого пролиферативного потенциала.Более низкая интенсивность экспрессии CD11b на нейтрофилах и моноцитахпуповиннойкровинедоношенныхноворожденныхможетоказыватьсущественное влияние на способность фагоцитарных клеток перемещаться кочагу инфекции и распознавать опсонизированные микроорганизмы.3.2.2.

Функциональная активность фагоцитов пуповинной кровиСледующим этапом фагоцитоза после распознавания чужеродных структурна поверхности микроорганизмов является активация мембраны фагоцита ипоглощение патогена. Методом проточной цитофлуориметрии была оцененапоглотительная активность нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов уноворожденных детей и взрослых (рис.

4).БСодержание клеток, %АНейтрофильныегранулоцитыИнтенсивностьфлуоресценции, MFI61МоноцитыНейтрофильныегранулоцитыМоноцитыРисунок 4. Содержание нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов,участвующих в фагоцитозе (А), иинтенсивность флуоресценции поглощенных бактерий (Б)Установлено, что содержание нейтрофилов и моноцитов, участвующих вфагоцитозе, статистически не различалось в группах доношенных (группа 2) инедоношенных (подгруппа 1а) детей. Корреляционная связь фагоцитарнойактивности клеток пуповинной крови с гестационным возрастом такжеотсутствовала (Р>0,05). В то же время, интенсивность флуоресценции E.coli,поглощенных нейтрофильными гранулоцитами и моноцитами, значимо ниже впуповинной крови недоношенных новорожденныхпо сравнению с детьми,родившимися в срок.

Следует отметить, что в группах новорожденных детейобнаруженапрямаяинтенсивностьюкорреляционнаяэкспрессииCD64зависимостьисреднейотносительнымсилымеждусодержаниемфагоцитирующих нейтрофилов (r=0,549 Р=0,02), а также интенсивностьюфлуоресценции поглощенных бактерий (r=0,60 Р=0,01).Важнейшиммеханизмомповреждениямикроорганизмовфагоцитамиявляется продукция активных форм кислорода. В результате активациинейтрофильных гранулоцитов и моноцитов фосфорилируется ферментныйкомплекс NADPH-оксидаза, что ведет к продукции кислородных радикалов –«респираторномувзрыву».Вслучаеневозможностипоглощениямикроорганизмов, повреждающее воздействие оказывают АФК, выделяемые во62внеклеточную среду. Интенсивность продукции внеклеточных кислородныхрадикалов была оценена по интенсивности свечения изолюминола, который неспособен проникать внутрь клетки и окисляется только внеклеточнымикислородными радикалами и люминола, способного легко проникать черезклеточную мембрану и отражающего окислительные процессы как снаружи, так ивнутри клетки.Оценку вклада распознающих рецепторов на поверхности фагоцитов впроцессгенерацииАФКпроводилисиспользованиемзимозана,опсонизированного нативной и инактивированной сывороткой крови.

Приопсонизации зимозана нативной сывороткой, содержащей иммуноглобулины икомпоненты комплемента, активация фагоцитирующих клеток происходит путемвзаимодействиястолл-подобнымирецепторами(вчастности,TLR2),рецепторами к Fcγ и рецепторами к C3 компоненту комплемента. Приинактивации сыворотки содержащиеся в ней компоненты комплемента меняютсвоюконформациюи,такимобразом,теряютсвоюопсонизирующуюспособность (при этом содержание белка остается на прежнем уровне). Такимобразом,зимозан,опсонизированныйинактивированнойсывороткой,взаимодействует с толл-подобными рецепторами и FcγRs на поверхностинейтрофилов и моноцитов и не связывается с рецепторами к комплементу.На рис.