Диссертация (Особенности иммунитета у недоношенных новорожденных детей с респираторными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза), страница 9

Установление наличиявзаимосвязи между изменениями в состоянии иммунной системы и развитиемвоспалительногопроцессаможетспособствоватьдиагностических или прогностических предикторов.определениюранних44Глава II. Материал и методы исследованияРабота выполнена на базе лаборатории клинической иммунологии,родильного отделения и отделения реанимации и интенсивной терапииноворожденных отдела неонатологии и педиатрии ФГБУ «Национальныймедицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологииимени академика В.И.

Кулакова» Министерства здравоохранения РоссийскойФедерации.В соответствии с поставленными задачами в исследование были включены113 проспективно обследованных новорожденных. Первую группу составили 76недоношенных детей, наблюдавшихся и проходивших лечение в отделенииреанимации и интенсивной терапии новорожденных. В последующем дети изданной группы были переведены на второй этап выхаживания в отделениепатологииноворожденных.Окончательныйклиническийдиагнозноворожденным устанавливался на 3 сутки жизни, исходя из результатовклинико-лабораторного обследования: анализ гемокультуры, рентгенологическоеисследование органов грудной полости, оценка содержания С-реактивного белка,клинический анализ крови. Вывод о наличии у ребенка инфекционногозаболевания делали на основании двух или более клинических симптомов иодного или более лабораторных признаков системной воспалительной реакции,илиприналичииинфильтративныхизмененийвлегкихподаннымрентгенографии органов грудной полости [21].

В соответствии с клиническимдиагнозом недоношенные дети были разделены на две подгруппы.В подгруппу 1а были включены 33 недоношенных новорожденных ребенкас наиболее благоприятным течением периода ранней неонатальной адаптации, неимеющие, или с минимально выраженными дыхательными нарушениями прирождении, без признаков воспаления. Среди них 10 детей наблюдались сдиагнозом респираторный дистресс-синдром и 23 ребенка – с диагнозомтранзиторное тахипноэ новорожденных.

Дети из данной группы были переведенына второй этап выхаживания в течение первых 5 суток после рождения.Гестационный возраст детей из данной подгруппы составил 31-36 недель.45Подгруппу 1б составили 43 недоношенных ребенка с врожденной пневмонией.Гестационный возраст детей из данной подгруппы находился в диапазоне 27-36недель. Во 2 группу включили 37 здоровых доношенных детей, наблюдавшихся вфизиологическом отделении новорожденных, течение ранней неонатальнойадаптации у них протекало без особенностей.

Новорожденные были выписаны вудовлетворительном состоянии на 3-5 сутки. Деление пациентов на группыпредставлено на рис.2.Новорожденные детиНедоношенные(Группа 1), n=76Без признаковинфекции(Подгруппа 1а), n=33Доношенные(Группа 2),n=37С врожденнойпневмонией(Подгруппа 1б), n=43Рисунок 2. Схема деления обследованных новорожденных на группыВ процессе выполнения работы обследование новорожденных из первойгруппы проводилось дважды: сразу после рождения и на 3-и сутки жизни.Обследование здоровых доношенных детей проводилось один раз сразу послерождения.Родителяминоворожденныхбылоподписанодобровольноеинформированное согласие на включение в исследование. Данная работа былаодобренаэтическимкомитетомФГБУ«Национальныймедицинскийисследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имениакадемикаВ.И.Кулакова»МинистерстваздравоохраненияРоссийскойФедерации.Критерии включения новорожденных в исследование:- Гестационный возраст новорожденных первой группы 27-36 недель, детейвторой группы 37 и более недель46- Рождение детей из группы 2 от практически здоровых женщин сфизиологическим течением беременности- Согласие родителей на обследование новорожденныхКритерии исключения новорожденных из исследования:- Гемолитическая болезнь по группе крови или резус-фактору- Врожденные пороки развития- Врожденный сепсис- Генетические заболевания- Врожденные иммунодефицитные состояния- Применение препаратов человеческих иммуноглобулинов- Гемотрансфузии в первые 72 часа жизниВ группе 1 материалом для исследования послужили образцы пуповинной ипериферической венозной крови, полученной на 3-и сутки жизни, у детей изгруппы 2 осуществлялся забор только пуповинной крови.Методы исследования.1.

Стандартные методы исследования.Клинико-лабораторное обследование новорожденного ребенка согласноклиническому протоколу по антибактериальной терапии у новорожденных,принятому в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.2. Специальные методы исследования.2.1.Подсчетфлуоресцентнойпопуляцийпроточнойлейкоцитовцитометрииосуществлялсянаметодомавтоматизированномгематологическом анализаторе Sysmex XT-2000i (Япония).2.2.Иммунофенотипирование – определение экспрессии поверхностныхрецепторов – проведено методом проточной цитофлуориметрии с применениеммеченныхFITC(флуоресцеинаизотиоцианат),PE(фикоэритрин),APC(аллофикоцианин), PerCP (перидинин-хлорофилл протеин) моноклональныхантител (мкАТ) к поверхностным маркерам CD11b, CD64, CD3, CD16, CD56,CD4, CD8, CD19, CD5, HLA-DR, CD14, γδTCR, CD38, CD27, IgM, IgG, CD95,CD114, CD116, TLR2, TLR4, CD25, CD127, CD268, CD267.

Согласно стандартной47процедуре окрашивания, цельную кровь с мкАТ инкубировали в темноте, затемлизировали эритроциты с одновременной фиксацией лейкоцитарных клетокраствором FACS Lyse (BD Biosciences, США). Пробы центрифугировали,надосадочную жидкость удаляли, клетки ресуспендировали в 200 мкл фосфатносолевого буфера (PBS). Перед окрашиванием В-клеток анти-IgM и анти-IgD мкАТпробы крови трижды отмывали фосфатно-солевым буфером для удаленияиммуноглобулинов, содержащихся в плазме крови [110].

Анализ данныхосуществляли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson,США) с применением программы Cell Quest (Becton Dickinson, США).Лейкоцитарный гейт, позволяющий исключить из анализа другие клетки крови,выявляли с помощью мкАТ к СD45 (Dako, Дания). Популяции лейкоцитов(лимфоциты,моноциты,нейтрофильныегранулоциты)определялипопоказателям прямого и бокового светорассеяния.2.3.Оценка интенсивности фагоцитоза проводилась методом проточнойцитофлуориметрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) сиспользованием коммерческого набора PHAGOTEST (Glycotope Biotechnology,Германия) согласно протоколу. Образцы цельной крови инкубировали притемпературе 37°С в течение 10 минут с FITC-меченными бактериальнымиклетками E.coli в концентрации 1,7х108/мл, контрольные образцы инкубировалина льду.

Затем в пробу вносился раствор для подавления флуоресценциинепоглощенных бактериальных клеток. Клетки крови дважды отмывалибуферным раствором, разрушали эритроциты и фиксировали лейкоциты путемдобавления лизирующего раствора, входящего в состав набора, повторноотмывали.

Добавление йодида пропидия перед анализом на проточном цитометрепозволяло по пику на гистограмме отделить фагоциты от непоглощенныхбактериальных клеток. Количество фагоцитарных клеток, поглотивших бактерии,определяли по флуоресценции в области, соответствующей спектру излученияFITC. За число фагоцитирующих клеток принимали разницу между количествомвступивших в реакцию фагоцитов при инкубации при 37°С и при инкубации на48льду.Зафагоцитарноечислопринималипоказательинтенсивностифлуоресценции в пересчете на одну фагоцитирующую клетку.2.4.Определение концентрации иммуноглобулинов IgM и IgG в плазмекрови проводили турбидиметрическим методом на биохимическом анализатореАБхФк (Россия) с применением коммерческих наборов (Human, Германия).

Вкювету, содержащую буфер и антииммуноглобулиновую сыворотку, вносилиисследуемый образец, инкубировали в течение 10 минут при 37°С. Измерениепроводили против холостой пробы, содержащей буфер и исследуемый образец инесодержащийантисыворотку.Количественнуюоценкусодержаниякислородапроводиласьиммуноглобулинов определяли по калибровочной кривой.2.5.Оценкапродукцииактивныхформхемилюминесцентным методом на 12-кюветном люминометре Хемилюм 2001(Россия). Данный высокочувствительный метод основан на регистрацииинтенсивностилюминесцентногосвечениязондаприсутствующегоприегоокислениивреакционнойпродуцируемымисредеклеткойкислородными радикалами.

В качестве люминесцентных зондов применялиизолюминол и люминол (Sigma-Aldrich, США). Оценивали интенсивностьиндуцированной хемилюминесценции и площадь под кинетической кривой. Вкачестве индукторов применяли форбол-12-миристат-13-ацетат (РМА, 5х10-7М)(Sigma-Aldrich, США) и опсонизированный зимозан (ОЗ и ОЗинакт, 0,25 мг/мл). ОЗи ОЗинакт готовили следующим образом: навеску зимозана (Sigma-Aldrich, США)растворяли в физиологическом растворе, добавляли равный объем пулированнойсыворотки крови здоровых взрослых доноров (для приготовления ОЗ инактсыворотку предварительно инактивировали при 56°С в течение 30 минут).Инкубировали при 37°С в течение 45 минут, после чего центрифугировали при300g 10 минут, надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали вфизиологическом растворе.

Аликвоты хранили при -20°С.2.6.Определение содержания цитокинов в плазме крови. Проводилиметодом мультиплексного анализа с применением 27-плексной панели (Bio-Rad,США) согласно протоколу. Оценивали содержание провоспалительных (IL-1b, IL-492, IL-6, IL-9, IL-12, IL-15, IL-17, IFNγ, TNFα), противовоспалительных (IL-4, IL-5,IL-10, IL-13, IL-1Ra) цитокинов, хемокинов (IL-8, Eotaxin, IP-10, MCP-1, MIP-1a,MIP-1b, RANTES) и ростовых факторов (IL-7, VEGF, PDGF-bb, G-CSF, GM-CSF,FGF-basic).Влункиплоскодоннойплашкичерногоцветавносилибуфер,флуоресцентно меченные магнитные микросферы с адсорбированными на ихповерхности антителами к цитокинам и образцы плазмы крови с ЭДТА в качествеантикоагулянта. По истечении времени инкубации содержимое лунок триждыотмывали буфером на промывочном устройстве, оснащенном магнитнойплатформой, и добавляли биотинилированные антитела к цитокинам для созданиямногослойного комплексного соединения.