Диссертация (Особенности иммунитета у недоношенных новорожденных детей с респираторными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза), страница 14

Вотличие от недоношенных новорожденных из 1а подгруппы, у детей сврожденной пневмонией также повышалась интенсивность флуоресценциибактериальных клеток, поглощенных нейтрофильными гранулоцитами (рис.14).Оценка интенсивности люминол-зависимой PMA-индуцированной ХЛпоказала, что суммарная продукция кислородных радикалов фагоцитамипуповинной крови при активации протеинкиназы С была значимо ниже вподгруппе детей с врожденной пневмонией, чем у новорожденных сходногогестационного возраста без признаков инфекции: 0,7 (0,30-1,23) усл.ед. против2,4 (1,15-4,20) усл.ед. (Р=0,0042). В периферической крови на 3 сутки жизнимежгрупповых различий обнаружено не было: 2,8 (1,69-6,18) усл.ед.

и 6,1 (3,907,30) усл.ед. (Р=0,14). При этом было отмечено, что в 1б подгруппеинтенсивность продукции АФК на 3 сутки была значимо выше, чем прирождении (Р=0,0039), в 1а подгруппе различия были не достоверны (Р=0,06).Результаты оценки внеклеточной и суммарной зимозан-индуцированнойпродукцииАФКфагоцитамипуповиннойипериферическойкровинедоношенных детей в зависимости от наличия врожденной пневмониипредставлены на рис. 15.80БИнтенсивность ХЛ, усл.ед.Интенсивность ХЛ, усл.ед.АГИнтенсивность ХЛ, усл.ед.Интенсивность ХЛ, усл.ед.ВРисунок 15. Интенсивность изолюминол-зависимой (А,Б) и люминолзависимой (В,Г) хемилюминесценции в пуповинной (белые маркеры) ипериферической (черные маркеры) крови недоношенных новорожденных детейпри активации зимозаном, опсонизированным нативной (А,В) иинактивированной (Б,Г) сывороткой кровиПоказано, что интенсивность люминол-зависимой ХЛ при активацииклеток опсонизированным зимозаном (рис.15, В) была ниже в 1б подгруппедетей с врожденной пневмонией.

Интенсивность изолюминол-зависимой ХЛзначимо не различалась (Р>0,05).Обращает на себя внимание, что в 1б подгруппе новорожденных спневмонией суммарная продукция кислородных радикалов фагоцитамипуповиннойкровизависелаотинтенсивностиэкспрессииTLR4нанейтрофильных гранулоцитах (r=0,721 P=0,019). Внеклеточная генерация АФКкоррелировала с интенсивностью экспрессии CD64 (r=0,745 Р=0,013) и TLR281(r=0,709 P=0,022) на нейтрофильных гранулоцитах. Продукция АФК в ответ наОЗинакт была связана с экспрессией CD64 (r=0,538 P=0,047), TLR2 (r=0,636P=0,048) и TLR4 (r=0,627 P=0,039).Оценка внеклеточной продукции АФК фагоцитами периферическойкрови выявила значимо более высокий уровень продукции кислородныхрадикалов в 1б подгруппе детей с врожденной пневмонией как при действииОЗ, так и при действии ОЗинакт.

Скорость реакции также была выше в даннойподгруппе: 0,008 (0,007-0,008) усл.ед./с против 0,002 (0,0007-0,003) усл.ед./спри активации ОЗ (Р=0,002) и 0,003 (0,002-0,004) усл.ед./с против 0,001 (0,00060,002) усл.ед./с при активации ОЗинакт (Р=0,03).У недоношенных детей без признаков инфекции интенсивность ХЛ впуповинной и периферической крови значимо не различалась. У детей сврожденной пневмонией на 3 сутки жизни внеклеточная и суммарнаяпродукция АФК фагоцитами цельной крови в ответ на стимулы быласущественно выше, чем при рождении.С целью поиска иммунологических маркеров для раннего выявленияврожденной пневмонии у недоношенных детей нами был проведен ROCанализ, с помощью которого оценена диагностическая значимость следующихпоказателей: содержание CD16+ моноцитов в пуповинной крови (mCD16),интенсивность экспрессии CD64 на нейтрофильных гранулоцитах (nCD64) иинтенсивность зимозан-индуцированной продукции АФК клетками крови(ROS).

Была построена кривая зависимости числа верно классифицированныхположительныхпримеров(чувствительность)отколичестваневерноклассифицированных отрицательных примеров (специфичность). Показателичувствительности,специфичности,положительнойпрогностической значимости указаны в табл.6.иотрицательной82Таблица 6.Диагностическая значимость исследуемых показателейПоказательcut-offSeSpPPVNPVAUCP-valuemCD16, %>14,0276,068,779,1464,690,7450,0016nCD64, MFI>44,089256,276,6581,800,7440,0026ROS, усл.ед.<2,139,410010048,70,6460,05Примечание: Se – чувствительность, Sp – специфичность, PPV – положительнаяпрогностическая значимость, NPV – отрицательная прогностическаязначимость, AUC – площадь под ROC-кривойПосколькуисследуемыепоказателидиагностическойзначимостью,мынеобладалипроанализировалидостаточнойчувствительность,специфичность и прогностическую значимость их сочетаний.

Согласнополученнымрезультатам,максимальнойдиагностическойзначимостьюобладает метод одновременной оценки интенсивности экспрессии CD64 нанейтрофильных гранулоцитах и зимозан-индуцированной продукции АФКклетками крови (рис.16).Se = 75,0% Sp = 80,0%AUC = 0,800 P<0,05Рисунок 16. ROC-кривая одновременного определения интенсивностиэкспрессии CD64 на нейтрофильных гранулоцитах и зимозан-индуцированнойпродукции АФК клетками крови для оценки их значимости в раннейдиагностике врожденной пневмонии у недоношенных детей83Дляпорогаотсечения0,619чувствительностьсоставила75,0%,специфичность – 80,0%, положительная прогностическая значимость – 85,7%,отрицательная – 66,7%. Площадь под кривой – 0,800 (0,659-0,941, P<0,05).В соответствии с классификацией Swets J.A. [147], площадь под ROCкривой от 0,5 до 0,7 свидетельствует о невысокой точности теста, тест сплощадью под ROC-кривой более 0,7 может быть использован в практике.Таким образом, одновременное определение интенсивности экспрессиивысокоаффинногоFcγRIнанейтрофильныхгранулоцитахизимозан-индуцированной продукции активных форм кислорода клетками пуповиннойкрови может быть использовано для ранней диагностики врожденнойпневмонии у недоношенных детей.

Расчет значения вероятности наличияврожденной пневмонии осуществляется по формуле:=11+ −(−3,113+0,08864+(−0,14))где nCD64 – значение интенсивности экспрессии высокоаффинного FcγRI нанейтрофильныхгранулоцитахпуповиннойкрови,ROS–показательинтенсивности люминол-зависимой ОЗ-индуцированной ХЛ. В случае, еслизначение р больше 0,619, у ребенка можно предположить наличие врожденнойпневмонии с вероятностью 85,7%.3.3.2. Фенотип лимфоцитов пуповинной и периферической кровинедоношенных новорожденныхПри оценке субпопуляционного состава лимфоцитов было отмечено, чтов пуповинной крови недоношенных детей с врожденной пневмониейсодержание NKT клеток с фенотипом CD3+CD16,CD56+ выше, чем уноворожденных сходного гестационного возраста без признаков инфекции:0,7±0,42% против 0,4±0,20% (Р=0,009), что может быть признаком активацииклеточного звена иммунной системы при внутриутробном заражении.84Содержание Т- и В-лимфоцитов остальных субпопуляций в пуповинной кровинедоношенных детей из 1а и 1б подгрупп значимо не различалось (Р>0,05).Повторное обследование недоношенных новорожденных на 3 суткижизнивыявилозначимоболеенизкоесодержаниеВ-лимфоцитоввпериферической крови детей без признаков инфекции по сравнению спуповинной кровью: 10,1±3,32% против 17,4±7,07% (Р=0,021).

Число Т-клеток,в том числе Т-хелперных и Т-регуляторных, напротив, к 3 суткам становилосьбольше (табл. 7).Таблица 7.Содержание лимфоцитов исследуемых популяций в пуповинной и венознойкрови недоношенных новорожденных (М±SD)МаркерПодгруппа 1а, n=12пуповиннаявенознаяР1аПодгруппа 1б, n=23пуповиннаявенознаяР1бCD3+64,8±17,5983,6±5,26 0,00968,9±11,5378,7±10,010,002CD3+CD4+46,8±15,2262,8±6,11 0,00948,8±9,2260,5±8,500,0001CD3+CD8+17,2±3,9521,8±8,890,0621,0±5,1620,7±3,930,75CD3+CD4+/CD3+CD8+2,7±0,512,9±0,550,162,4±0,533,0±0,840,0001CD3-CD16,CD56+18,8±14,56,7±3,60,0615,3±8,606,8±4,540,0002CD3+CD16,CD56+0,4±0,200,5±0,350,690,7±0,420,5±0,340,19CD3+γδTCR+1,6±0,491,4±0,610,271,7±1,031,1±0,630,040,02±0,007 0,090,02±0,010,01±0,0080,05CD3+γδTCR+/CD3+0,03±0,013CD3+HLA-DR+0,5±0,190,8±0,760,231,1±3,140,5±0,330,35CD3–HLA-DR+17,4±7,2711,2±4,810,0116,2±8,2714,0±7,340,17CD95+19,5±18,3633,5±20,31 0,0934,1±22,032,7±24,100,67CD16+16,7±11,97,1±3,00,06316,3±9,437,5±5,440,0001Трег3,7±1,285,8±1,570,0054,7±0,756,2±1,310,003Трег/CD3+CD4+0,09±0,040,08±0,020,820,1±0,020,1±0,030,10Примечание: Р1а, Р1б – значимость различий между показателями в пуповиннойи периферической крови85В отличие от новорожденных без признаков инфекции, у детей сврожденной пневмонией на 3 сутки наблюдалось значимо более низкоесодержание γδ Т-клеток, число NK клеток, CD16+ лимфоцитов и интенсивностьэкспрессии данного рецептора; существенно выше в периферической крови посравнению с пуповинной был иммунорегуляторный индекс.Интенсивность экспрессии (MFI) апоптотической молекулы CD95 налимфоцитах и рецептора к IL-2 (CD25) на Т-регуляторных клетках в венознойкрови недоношенных новорожденных с пневмонией также была статистическизначимо выше, чем в пуповинной: 18,8 (16,38-26,26) против 13,9 (12,48-19,82)(Р=0,003)и54,1(48,15-65,92)против42,5(39,98-46,48)(Р=0,001)соответственно.Выявлена тенденция к увеличению доли CD19+CD27+ В-лимфоцитовпамяти в 1б подгруппе детей с врожденной пневмонией к 3 суткам жизни (5,0(3,85-6,80)% против 2,6 (1,96-3,31)%, Р=0,05) за счет увеличения числа Вклетокпамяти,вкоторыхнепроизошлопереключенияклассовиммуноглобулинов (3,3 (2,92-4,51)% против 2,0 (1,54-2,50)%, Р=0,0098).Значимыхмежгрупповыхразличийвсодержаниилимфоцитовисследуемых популяций в венозной крови недоношенных детей 3-х сутокжизни выявлено не было (Р>0,05).Таким образом, в отличие от новорожденных без инфекционновоспалительных заболеваний, у детей с врожденной пневмонией к 3 суткамжизни обнаруживаются признаки дифференцировки и «обучения» клетокадаптивной иммунной системы.Результаты оценки содержания иммуноглобулинов классов G и M вплазме крови недоношенных детей при рождении и на 3 сутки жизнипредставлены в табл.