Диссертация (Особенности иммунитета у недоношенных новорожденных детей с респираторными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза), страница 12

5 представлена оригинальная запись кинетической кривойинтенсивности изолюминол- и люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ)приактивацииАФК-продуцирующихклетокцельнойкровизимозаном,опсонизированным нативной и инактивированной сывороткой крови. Следуетотметить, что максимальная амплитуда изолюминол- и люминол-зависимой ХЛпри действии ОЗ и ОЗинакт не различалась. Это может свидетельствовать о том, чтовозможные нарушения в процессе распознавания патогенов фагоцитами неприводят к нарушению способности иммунных клеток продуцировать АФК.А20151050ОЗ,ОЗинакт3025Б20151050ОЗ,ОЗинакт161121181241301361421481541601661721781841901961102110811141120112611321138125Интенсивность ХЛ, усл.ед.301611211812413013614214815416016617217818419019611021108111411201126113211381Интенсивность ХЛ, усл.ед.63Время, сОЗОЗ инакт.Время, сОЗОЗ инакт.Рисунок 5.

Оригинальная запись кинетической кривой интенсивности индуцированной изолюминол- (А) илюминол-зависимой (Б) хемилюминесценции клеток цельной кровиХЛ – хемилюминесценцияОЗ – зимозан, опсонизированный нативной сывороткой кровиОЗинакт – зимозан, опсонизированный инактивированной нагреванием сывороткой крови64Намибылавычисленасредняяскоростьреакции:отношениемаксимальной амплитуды ответа (усл.ед.) к времени, за которое реакциядостиглаплато(с).Установлено,чтопридействиизимозана,опсонизированного инактивированной сывороткой крови, ответ клеток в обеихгруппах новорожденных более медленный, чем при действии зимозана,опсонизированного нативной сывороткой (Р<0,0001 в обоих случаях).

Скоростьреакции (усл.ед./с) как при действии ОЗ, так и при действии ОЗинакт, была нижеСкорость выхода на плато, усл.ед./св подгруппе 1а по сравнению с группой 2 (рис. 6).ОЗОЗ инакт.Рисунок 6. Скорость выхода реакции на плато при действии зимозана,опсонизированного нативной (ОЗ) и инактивированной (ОЗ инакт.) сывороткойкрови, усл.ед/с.Согласноимеющимсяданным,фагоцитыраспознаютнетолькоантигенные структуры на поверхности патогенов, но и опсонины, связанные сними, поэтому опсонизация существенно повышает интенсивность поглощениямикроорганизмов. В качестве опсонинов выступают иммуноглобулины икомпонентыкомплемента.предотвращениюНагреваниеклассическогоисывороткиальтернативногокровипутиведеткактивациикомплемента.

В исследовании Moore M.A. [109] было показано, чтоинактивация сыворотки крови при 57°С в течение 30 минут ведет к снижениюсвязывания комплемента с бактериальными клетками и более низкой65интенсивности люминол-зависимой ХЛ нейтрофильных гранулоцитов приактивации опсонизированными такой сывороткой бактериями по сравнению саналогичными показателями при действии бактерий, опсонизированныхнативной сывороткой.

В другом исследовании [77] выявлен значимо болеенизкий фагоцитарный индекс макрофагов при опсонизации бактериальныхклеток инактивированной сывороткой крови, соизмеримый с соответствующимпоказателем при поглощении неопсонизированных бактерий.На рис. 7 представлено сравнение интенсивности внеклеточной исуммарной продукции АФК. Доля внеклеточной (изолюминол-зависимой)продукции АФК от суммарной (люминол-зависимой) составила:при активации ОЗ:29% (25,0%-35,6%) в подгруппе 1а и 32% (28,7%-34,9%) во 2 группе;при активации ОЗинакт:26% (20,9%-27,4%) в подгруппе 1а и 25% (23,2%-28,4%) в группе 2.25Интенсивность ХЛ, усл.ед.Интенсивность ХЛ, усл.ед.Межгрупповых различий выявлено не было (Р>0,05).20151050ПодгруппаГруппа 1а 1аГруппа 22520151050Группа 1а1аПодгруппаГруппа 2Рисунок 7.

Сравнение внеклеточной и суммарной продукции активныхформ кислорода (АФК) фагоцитами крови при активации зимозаном,опсонизированным нативной (А) и инактивированной (Б) сывороткой кровиНизкая внеклеточная продукция АФК объясняется механизмом действиязимозана: взаимодействуя с TLR2 и рецепторами к опсонинам, он активирует66фагоцитоз, поэтому значительная часть АФК образуется в фагосомах,локализованных внутриклеточно.При оценке интенсивности ОЗ- и ОЗинакт.-индуцированной изолюминол- илюминол-зависимой ХЛ было установлено, что внеклеточная и суммарнаяпродукция кислородных радикалов значимо ниже в пуповинной кровинедоношенных детей по сравнению с доношенными (рис.

8).БИнтенсивность ХЛ, усл.ед.Интенсивность ХЛ, усл.ед.АОЗОЗ инакт.ОЗОЗ инакт.Рисунок 8. Интенсивность изолюминол-зависимой (А) и люминол-зависимой(Б) хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, опсонизированнымнативной (ОЗ) и инактивированной (ОЗинакт.)сывороткой кровиСледует отметить наличие прямой корреляционной зависимости междуинтенсивностью внеклеточной (r=0,573 Р=0,0006) и суммарной (r=0,666Р˂0,0001) ОЗ-индуцированной продукции АФК клетками пуповинной крови игестационным возрастом новорожденных , а также с абсолютным содержаниемнейтрофильныхгранулоцитов(r=0,518P=0,023иr=0,770P=0,0001соответственно).Чтобы оценить особенности ферментной системы, участвующей вгенерации АФК у новорожденных, нами было проведено исследованиепродукции кислородных радикалов при действии форбол-12-миристат-13ацетата (PMA).

Форболовые эфиры, к числу которых относится PMA, легко67проникают в клетку и взаимодействуют с протеинкиназой С – ключевымферментом,активирующимNADPH-оксидазу.Результатомданноговзаимодействия является индукция «кислородного взрыва» в фагоцитах безИнтенсивность ХЛ, усл.ед.вовлечения рецепторного аппарата клеток. Результаты представлены на рис.9.Подгруппа 1аГруппа 2Рисунок 9.

Интенсивность PMA-индуцированной люминол-зависимойхемилюминесценции в исследуемых группахПродукция кислородных радикалов в ответ на действие РМА былазначимо ниже в пуповинной крови недоношенных новорожденных (подгруппа1а) по сравнению с доношенными (группа 2) и напрямую зависело отгестационного возраста (r=0,667 P=0,001).Такимобразом,низкаяпоглотительнаяактивностьфагоцитовпуповинной крови и экспрессия на них рецепторов, распознающих патогенассоциированные молекулы и опсонины на поверхности микроорганизмов, атакже незрелость ферментной системы, участвующей в процессе образованиякислородных радикалов, обусловливают низкую продукцию активных формкислорода и, как следствие, недостаточную бактерицидную способностьнейтрофильных гранулоцитов и моноцитов у недоношенных новорожденных.Низкаяфункциональнаяактивностьклетокврожденногоиммунитетаобусловливает повышенную восприимчивость данной группы детей квозбудителям инфекционно-воспалительных заболеваний.683.2.3.

Субпопуляционный состав лимфоцитов у новорожденныхАктивация клеток врожденного иммунитета ведет к вовлечению виммунныйответэффекторовадаптивногозвенаиммуннойсистемы,результатом чего является развитие антиген-специфичного иммунного ответа иформирование иммунологической памяти.Получены данные о значимо более высоком относительном содержаниилимфоцитов в пуповинной крови недоношенных новорожденных по сравнениюс детьми, рожденными в срок.

Не выявлено статистически значимыхмежгрупповыхразличийсубпопуляций (табл. 4).всодержаниилимфоцитовисследуемых69Таблица 4.Фенотип лимфоцитов пуповинной крови новорожденных детей, M±SDПодгруппа 1а,Группа 2,n=16n=1944,4±15,2635,2±5,750,0095,4±2,084,8±1,540,3370,0±16,1869,0±14,430,844,2±1,963,6±1,080,3951,3±12,7652,1±8,190,84х109/л3,1±1,532,4±0,800,24%20,0±6,2922,0±5,890,37х109/л1,2±0,571,1±0,330,662,7±0,652,5±0,780,460,4±0,200,46±0,250,390,02±0,0130,02±0,0190,54%1,5±0,511,5±0,730,96х109/л0,06±0,040,08±0,070,660,02±0,0120,02±0,0140,970,4±0,190,4±0,160,950,03±0,0170,02±0,0100,233,7±1,283,4±0,590,490,2±0,170,2±0,050,61CD4+CD25highCD127low/–/CD3+CD4+0,08±0,040,07±0,010,41CD3–HLA-DR+%15,8±6,1816,4±4,690,75х109/л1,0±0,660,8±0,440,30%31,0±33,534,1±26,040,77х109/л2,2±1,921,7±1,680,44ПоказательОбщее содержаниеCD3+%х109/л%х109/лCD3+CD4+CD3+CD8+%CD3+CD4+/CD3+CD8+CD3+CD16,CD56+%х109/лCD3+γδTCR+CD3+γδTCR+/CD3+CD3+HLA-DR+%х109/лCD4+CD25highCD127low/– %х109/лCD95Р70Обращает на себя внимание, что в 1а подгруппе недоношенных детейлимфоцитысбольшейинтенсивностьюэкспрессируюткорецепторнуюмолекулу CD4 и рецептор γδTCR по сравнению с детьми, родившимися в срок:1098,2 (1060,06-1157,32) против 898,7 (862,92-966,68), Р=0,0014 и 81,1 (64,60101,76) против 57,5 (52,97-61,35), Р=0,0038 соответственно.

Интенсивностьэкспрессии данных маркеров обратно коррелирует с гестационным возрастомноворожденных: r = – 0,396, P=0,03 и r = – 0,385, P=0,039.Анализ содержания Т-регуляторных клеток проводили с применениеммоноклональных антител к поверхностным молекулам CD45, CD4, CD25,CD127, что позволило исключить этап пермеабилизации мембраны дляокрашивания внутриклеточного фактора FOXP3, являющегося маркером Трегуляторных клеток. Ранее было показано, что популяция Т-регуляторныхлимфоцитов (CD4+CD25+FOXP3+) имеет фенотип CD4+CD25highCD127low/– [134].Стратегия гейтирования представлена на рис. 10.711234T регРисунок 10. Стратегия гейтирования при анализе содержанияТ-регуляторных клеток1 – определение лимфоцитарной области по показателям прямого (FSC)и бокового (SSC) светорассеяния, 2 – выделение CD45+ лимфоцитов, 3 –определение CD4+ Т-хелперных клеток, 4 – выделение среди CD45+CD4+лимфоцитов CD25highCD127low/– Т-регуляторных клеток(T-рег)Содержание(%)Т-регуляторныхклетоксфенотипомCD4+CD25highCD127low/– в пуповинной крови составило 3,7 (2,96-4,81) в 1аподгруппе недоношенных детей и 3,4 (3,10-3,75) – в группе здоровыхдоношенных новорожденных.

Значимых различий при сравнении содержанияТрег клеток в пуповинной крови доношенных и недоношенных детей невыявлено (Р>0,05). Интенсивность экспрессии (MFI) рецептора к IL-2 (CD25)наТрегклеткахпуповиннойкровидоношенныхинедоношенныхноворожденных составила соответственно 35,9 (31,54-47,59) и 41,7 (39,1144,66) и также значимо не различалась.72Существенные различия были выявлены при исследовании фенотипа Влимфоцитов. По экспрессии молекул CD19, CD5, CD27, IgM и IgD наповерхности лимфоцитов различают субпопуляции CD19+CD5– B2, CD19+CD5+B1 клеток, CD19+CD27–IgM+IgD– незрелых, CD19+CD27–IgM+IgD+ наивныхлимфоцитов и CD27+ В-лимфоцитов памяти, среди которых выделяют клеткипамяти, в которых не произошло переключения класса иммуноглобулинов(«непереключенные») с фенотипом CD19+CD27+IgM+IgD+ и CD19+CD27+IgM–IgD– В-клетки памяти после переключения.