Диссертация (Клиническое значение эндотелиальной дисфункции в развитии акушерских и перинатальных осложнений), страница 11

Исследование терапии эндотелиальной дисфункции преследуетэту цель, позволяя определить на основе доказательной медицины новые путипрофилактики акушерской и перинатальной патологии.60ГЛАВА II. КОНТИНГЕНТ, МЕТОДЫ И ПРОГРАММАИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Контингент исследованияВсего в работе обобщены данные клинико-лабораторного обследования 530женщин в период беременности, а также 163 детей в возрасте до 1 года.Проспективное исследование методом «случай-контроль» проведено в 3 этапа. НаI этапе обследовано 180 беременных в I триместре, госпитализированных вотделения гинекологии ГБУЗ ГКБ №13 ДЗ г. Москвы, у которых беременностьбыла прервана: у 90 пациенток диагностирована неразвивающаяся беременность,и у 90 женщин проведен медицинский аборт по желанию. На II этапе у 163пациенток с одноплодной беременностью исследовано течение I, II и IIIтриместров, проанализировано течение родов, состояние 163 новорожденныхдетей и их катамнез на первом году жизни. На III этапе проведен анализприменения гормональной, антиагрегантной и антикоагулянтной терапии вовремя беременности.

Всего на III этапе исследования изучено применениевышеуказанной терапии у 276 пациенток.2.2. Методы исследования1. Клинико-статистическая характеристика обследованных женщин.2. Лабораторные методы исследования.3. Инструментальные методы исследования.4. Статистическая обработка полученных данных.2.2.1. Клинико-статистическая характеристика обследованных женщинИсследование проведено проспективным методом с использованиемстандартизированныхкарт,позволяющихсистематизироватьособенностианамнеза, состояния здоровья женщин, течения беременности и родов, а также61состояния здоровья новорожденных и их катамнез на первом году жизни(приложение 1).

Все женщины I этапа исследования находились на стационарномлечении в гинекологических отделениях ГБУЗ ГКБ №13 ДЗ г. Москвы, гдепроводилоськомплексноеобследование.Приисследованиианамнезаучитывались такие особенности, как образ жизни, перенесенные соматическиезаболевания, вредные привычки. Изучался личный и семейный тромботическийанамнез, выяснялось наличие у больной и её родственников тромбофилическихнарушений: тромбозов, нарушений мозгового кровообращения, острых сердечнососудистыхнарушений.Изучалосьсостояниеменструальнойфункции:определялся возраст менархе, наличие нарушений менструального цикла.Изучалсяакушерскийигинекологическийанамнез.Приисследованиирепродуктивной функции определялось наличие в анамнезе, привычногоневынашивания,бесплодия,изучалосьтечениеиисходпредыдущихбеременностей.Проводился общий осмотр, исследовались антропометрические показателии индекс массы тела.

Определялось состояние основных систем организма, попоказаниям проводились дополнительные обследования и консультации смежныхспециалистов.Пригинекологическомосмотреисследовалосьсостояниенаружных и внутренних половых органов, наличие признаков местноговоспаления и т.д.НаIIэтапеисследованиядополнительнопроводилосьпассивноединамическое исследование течения беременности и родов, выполняласьвыкопировка данных обменных карт, историй беременности и историй родовродильных домов города Москвы и Московской области. Оценку состоянияноворожденных проводили по шкале Апгар на 1-й и 5-й минуте.

Степеньгипоксического поражения у новорожденных определялась с использованиемклассификацииперинатальныхпораженийЦНС.Всерожденныедетинаблюдались в поликлиниках города Москвы и Московской области и проходилиплановоеобследование,осмотрыпрофильныхспециалистов.Катамнезисследуемых детей в возрасте до 1 года собран с помощью выкопировки данных62историй новорожденных и амбулаторных карт родильных домов и поликлиникгорода Москвы и Московской области.2.2.2. Лабораторные методы исследованияУбеременныхпроводилисьвсерегламентированныелабораторныеисследования (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 ноября 2012 г.

№572н "Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю«Акушерство и гинекология»):1) Общий анализ крови проводился с помощью штатных лабораторныхпроточных гематологических анализаторов.Забор крови для исследованияосуществлялся по унифицированной методике в утреннее время в пластиковыепробирки, содержащие стандартное количество распыленного антикоагулянтаЭДТА.2) Групповая принадлежность и наличие резус-фактора, а также, при отсутствиирезус-фактора, наличие и титр антител – с помощью стандартизированныхсывороток.3) ГомональноеобследованиевХГчкровипроводилосьметодомиммуноферментного анализа.4) Исследованиесвертывающейсистемывключалоизучениеследующихпоказателей:a) Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Метод:определениевременистандартизированнойсвертыванияконтактнойплазмы(каолином)кровиивусловияхфосфолипидной(кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция.b) Протромбиновый индекс (ПТИ) – cooтнoшeниe вpeмeни свертыванияплaзмы пaциeнтa к вpeмeни свертывания плaзмы здopoвoгo чeлoвeкa,выpaжeннoe в пpoцeнтax.

Метод: определение в присутствии ионов кальцияи тканевого тромбопластина времени образования фибрина в плазме крови.c) Протромбиновое время – характеристика активности протромбиновогокомплекса (факторов II, VII, V и X). Метод: опредлеление времениобразования сгустка фибрина в цитратной плазме при добавлении к ней63растворакальцияхлоридаитканевогостандартизированноготромбопластина, то есть тромбопластина известной активности.d) Фибринген.цитратнойМетод: определение времени свертывания разбавленнойплазмыкровипоследобавленияизбыткатромбинапропорционально концентрации фибриногена.e) Meждунapoднoe нopмaлизoвaннoe oтнoшeниe (MHO) – pacчeтнoe знaчeниe,aбcoлютнoe чиcлo, пoкaзывaющee oтнoшeниe пpoтpoмбинoвoгo вpeмeни(ПВ) пaциeнтa к eгo cтaндapтнoму знaчeнию: MHO = (ПВ больного / ПВконтрольнойплазмы)×МИЧ.МИЧ(ISI)–международныйиндексчувствительности, показывающий относительную чувствительность даннойсерии использованных тромбопластинов по сравнению с эталономтромбопластина, чувствительность которого принимается за единицу.f) D-димер – продукт распада фибрина, небольшой фрагмент белка,присутствующий в крови после разрушения тромба (процесс фибринолиза).Метод определения: количественный метод латексной агглютинации.5) Общий анализ мочи проводился с помощью стандартизированной технологии,включающей макроскопическую оценку с описанием физических свойств,химические исследования и микросокпическое исследование осадка мочи.6) Микробиологическое исследование отделяемого влагалища и цервикальногоканала: микросокпическое исследование, исследование методом полимеразнойцепной реакции (ПЦР) тест-системами Фемофлор, бактериологический посевна питательную среду с определением чувствительности к антибаиотикам.7) Стандартное иммунологическое обследование: выявление антител ВИЧ,Treponema pallidum, HCV, HbsAg методом иммуноферментного анализа.8) Исследование сыворотки крови на наличие антикардиолипиновых антител,волчаночного антикоагулянта (Ig M, Ig G, Ig A) методом иммуноферментногоанализа.9) Исследованиемаркеровиммуноферментногоанализанаследственныхопределялисьтромбофилий.гомоцистеин,Методомантителакпротормбину и фосфатидилсерину, методом ПЦР выявлялись мутации64метилентетрагидрофолатредуктазымутацииMTHFR,ингибитораплазминогена PAI-1, Лейденовской мутации (F5), мутации гена протромбинаG20210A (F2).Длявыполненияпоставленныхзадачвработеиспользованыдополнительные лабораторные методы исследования:1) Количественное определение С-реактивного белка высокочувствительнымметодом иммунотурбидиметрии с латексным усилением (hs-СРБ).2) Количественное определение фактора фон Виллебранда методом непрямоготвердофазного иммуноферментного анализа с использованием отечественныхобразцов моноклональных антител.3) Количественное определение белка апоптоза р53 в сыворотке крови методомиммуноферментного анализа.4) Количественноеопределениеальбуминавобразцахмочиметодомиммуноферментного анализа иммунотурбидиметрическим методомВсе исследования проводились на базе лаборатории ГБУЗ ГКБ №13,родильных домов и детских поликлиник города Москвы и Московской области, атакже в коммерческих лабораториях города Москвы.2.2.3.Инструментальные методы исследования1)Определение количества десквамированных эндотелиоцитов (ДЭК) впериферической крови.

Исследование проводили по методике, разработаннойJ.Hladovec с соавт. в 1978 г. [154]. Мы использовали модификацию методаподсчетаДЭК,включающуюпомимосепарациидесквамированныхэндотелиоцитов из плазмы крови единовременную окраску препарата 0,1%раствором метиленового синего (Овсяник Д.М., Фомин А.В., 2014) [77]:1. Пробирку с кровью центрифугируют (1000 оборотов/мин) в течение 10мин.2. В пластиковую пробирку переносят 1 мл полученной плазмы идобавляют 0,1 мл 0,1% раствора АДФ.653.

Пробирку встряхивают в течение 10 минут при комнатной температуре ицентрифугируют (2000 оборотов/мин) в течение 10 минут.4. Из полученной надосадочной жидкости переносят 0,2 мл в пластиковуюпробирку и добавляют 40 мкл 0,1% раствора метиленового синего. Через 5минут проводят микроскопию полученного материала (600×) для выявленияциркулирующих ДЭК.5. Подсчет циркулирующих эндотелиальных клеток проводят во всёмобъеме камеры Горяева (10 мкл), начиная с её верхнего левого угла.