Диссертация (Клиническое значение эндотелиальной дисфункции в развитии акушерских и перинатальных осложнений), страница 8

Референсные значения результатов теста на vWF неимеют общепринятых диапазонов, что сопряжено с техникой определения этоголабораторного параметра. Повышение концентрации vWF в плазме кровипроисходит при стимуляции или повреждении сосудистого эндотелия, индукцииадгезии и агрегации тромбоцитов. Иногда умеренное повышение vWF выявляетсяу здоровых людей, а нормальный уровень – при легком варианте болезниВиллебранда.

Физиологическое увеличение количества и активности этогопротеина происходит при интенсивной физической нагрузке, в состоянии стресса,43в период беременности и родов, при приеме гормональных контрацептивов, вопределенные фазы менструального цикла. Установлено, что повышение уровня иактивностиvWFчастосопровождающихсянаблюдаетсяхроническимвклиническихдиссеминированнымситуациях,внутрисосудистымсвертыванием крови, диабетических ангиопатиях, ИБС, гипертонической болезнии т.д. Снижение концентрации vWF выявлено при гипотиреоидизме и системнойкрасной волчанке [27].Биохимическим маркером эндотелиальной дисфункции является такжегомоцистеин.

У взрослых уровень ГЦ колеблется в районе 10-11 мкмоль/литр. Поданным литературы, увеличение концентрации ГЦ на 5 мкмоль/литр повышаетриск повреждения сосудистой стенки на 60% у мужчин и на 80% у женщин [14].Повышение уровня ГЦ вызывают генетические мутации, недостаок поступленияили нарушение всасывания в кишечнике витаминов-кофакторов, участвующих вметаболизме ГЦ, табакокурение, гиподинамия, алкоголизм, а также такиефакторы, как пол, возраст или раса [14].ДляоценкиконцентрацииэндотелиальнойС-реактивногобелкадисфункции(СРБ).Виспользуютопределениелабораториииспользуетсявысокочувствительный метод определения hsСРБ («high sensitive» – англ.) дляопределения уровня СРБ в диапазоне 0,05-1,0 мг/л.

Установлено, что hsСРБявляетсямаркеромразвитиясердечно-сосудистыхосложненийболееинформативным, чем уровень холестерина или ЛПНП. В.С. Савельев (2010)оценил риски развития эндотелиальной дисфункции по параметрам концентрациивысокочувствительного С-реактивного белка в сыворотке крови: менее 1 мг/мл –риск минимальный; 1,1-1,9 мг/мл – риск низкий; 2,0-2,9 мг/мл – риск средний;более 3 мг/мл – высокий [100]. Однако этот показатель не может быть строгоспецифичным для эндотелиальной дисфункции, т.к.

повышается при большомколичестве патологических состояний, сопряженных с развитием воспалительнойреакции: бактериальные и вирусные инфекции,острая сердечная патология,онкологическиевмешательствазаболевания,оперативные(нарушениецелостности тканей), травмы и ожоги, туберкулез, системная красная волчанка,44лейкоз и лимфогранулематоз, ревматизм, болезни Кушинга, висцеральныйлейшманиоз и т.д.Немаловажную роль в диагностике эндотелиальной дисфункции отводитсямолекулам клеточной адгезии.

sPECAM – растворимая форма молекулымежклеточной адгезии PECAM-1, продукт протеолитического отщепленияPECAM-1/CD31 с поверхности клеток эндотелия. Будучи экспрессированным наэндотелиоцитах,тромбоцитахтрансэндотелиальнуюимиграциюлейкоцитах,лейкоцитоврегулируетPECAM-1привоспалении,атакжеконтролирует ангиогенез. При протеолитическом отщеплении PECAM-1 ипоявлении в растворимой форме в экстрацеллюлярном пространстве sPECAM-1маркирует повреждение клеток эндотелия [40; 62; 187].В литературе предложен метод определения микроальбуминурии (МАУ)длядиагностикиэндотелиальнойдисфункции[54].Микроальбуминуриямаркирует экскрецию почками альбумина в таких количествах, которыеневозможно определить с помощью стандартных методов.

МАУ диагностируютпри концентрации альбумина 25-300 мг/сутки. Уменьшение просвета выносящейартериолы в результате изменения стенки сосуда или воздействия медиаторовприводит к повышению внутригломерулярного давления и, как следствие, кгиперфильтрации альбуминов в первичную мочу [190]. По данным Р.Х. Кошухова(2011), микроальбуминурия является одним из наиболее точных маркеровпоражения сосудистой стенки [54]. Тем не менее, следует отметить, что МАУтакже является прогностическим признаком развития сердечно-сосудистыхзаболеваний и сахарного диабета [190].Такжедлядиагностикиэндотелиальнойдисфункцииприменяютисследование параметров свертывающей системы. Кроме упомянутых вышефакторафонВиллебрандаигомоцистеина,используютопределениефибронектина, tРА и РАI-1, аннексина V и тромбоксана А2, как показателейактивациивнутрисосудистогосвертывания[14],однакоэтипараметрынизкоспецифичны, и чаще используются в качестве маркеров гематологическихнарушений.45В литературе описана диагностика эндотелиальной дисфункции по уровнюмаркеров атеросклероза: ЛПНП и холестерина [197].

Эти параметры напрямуюсвязаны с жировым обменом и не совсем информативны в характеристикепоражения эндотелиоцитов. Встречаются исследования оценки медиатороввоспаления в качестве маркеров эндотелиальной дисфункции. Проводилосьисследование уровней Р–селектина, TNF-альфа, IL-1, IL-6 и т.д. [178]. Но методыих определения в большей части представляют только научный интерес.Таким образом, на сегодняшний день науке известен большой спектрбиохимических исследований, направленных на оценку функции эндотелия.Следует констатировать, что большинство методик не могут отразить точноесостояние эндотелиального аппарата. Оценка функции эндотелия теоретическиможет проводиться по снижению синтеза NO, что, однако, затруднено из-занестабильности и короткого периода жизни молекулы NO – прямого маркерафункции эндотелия.

Остальные же биохимичсекие маркеры дают косвеннуюоценку, т.к. соповождают многие другие сосудистые, иммунологические иобменно-эндокринные заболевания, а у беременных меняют свой уровень и вфизиологических условиях. Подавляющее большинство данныхвеществсинтезируется помимо эндотелиоцитов во многих других клетках организма, чтоуменьшает их диагностическую ценность. Практически все вышеуказанныемаркеры дают косвенную оценку работы состояния эндотелия, их интерпретациядолжнаучитыватьсопутствующуюпатологию,чтотакжевлияетнаобъективность и точность представленных методик.1.3.3. Цитологическая диагностикаК клеточным маркерам эндотелиальной дисфункции относят количестводесквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) [154].

Повреждение интимысосудов сопровождается усилением десквамации эндотелиальных клеток. ДЭК –это клетки, отделившиеся от стенки сосуда в процессе его повреждения [170] ициркулирующие в кровотоке, что позволяет регистрировать их методамимикроскопии. По данным научной литературы, ДЭК могут являться прямым46клеточным маркером поражения сосудистой системы [123]. Важно, что процессповреждения эндотелия является системным: десквамация эндотелия выявляетсяне только в сосудах пораженного органа, но и в периферических сосудахпациента [154]. В норме количество ДЭК очень мало, так как обновлениеэндотелиоцитов присходит медленно, а поврежденные клетки удаляются изсистемногокровотокамакрофагамипечени,лёгкихиселезёнки[147].Длительность нахождения десквамированных эндотелиоцитов в крови составляет24-42 часа, в течение которых происходит их разрушение [48].

Тем не менее, вомногих исследованиях продемонстрирован рост концентрации ДЭК при седечнососудистых заболеваниях, сахарном диабете, васкулитах, злокачественныхновообразованиях и т.д. [166; 170]. Таким образом, увеличение количествациркулирующих эндотелиоцитов в периферической крови расценивается какотражение системного поражения сосудистой системы [147].Впервые циркулирующие в периферической крови негематологическиеклетки были обнаружены Е.Н. Pool в 1934 году у онкологических больных.

Впоследующем, на основании исследований морфологии С.А. Bouvier и соавт.(1970) установили эндотелиальное происхождение интактных, содержащих ядраклеток [139]. В 1978 г. J.Hladovec и соавт. описали «эндотелиемию» у крыс привведении вазоактивных лекарственных препаратов [154].Десквамированные эндотелиальные клетки имеют толщину 1-2 мкм идиаметр 10-50 мкм, при микроскопии ДЭК обнаруживается их выраженнаяморфологическаянеоднородность:фиксируетсянарушениецелостностиплазматической мембраны, изменение геометрических параметров ядра и самойклетки [123]. Морфологическими признаками апоптозной гибели клетки являютсяуменьшение объема цитоплазмы, сокращение цитоплазматической мембраны,конденсацияифрагментацияядра,формированиеапоптозныхтелец–мембранных везикул с внутриклеточным содержимым [71].Подсчет количества циркулирующих ДЭК, предлженный J.Hladovec c соавт.(1978), основан на визуальной количественной оценке десквамированных клеток спомощью световой микросокпии.

Венозная кровь отбирается в пробирки,47стабилизируется 3,8% раствором цитрата натрия, центрифугируется (1000оборотов/мин в течение 10 мин). Тромбоцитарная масса отделяется путемдобавления раствора АДФ, супернатант перемешивается в течение 10 мин ицентрифугируется (1000 оборотов/мин в течение 20 мин). Надосадочная жидкостьсливается и к преципитату добавляется 0,1 мл 0,9% раствора NaCl. Подсчетколичества ДЭК осуществляется в 2 сетках цитометрической камеры спересчетом на 1 л плазмы с учетом изменения концентрации в процессепроведения вышеописанной методики.

Этот метод нашел широкое применениедля прогнозирования тяжести течения многих заболеваний, сопряженных споражением сосудистой системы [37; 45; 48; 100 и др.]. По методу J.Hladovec cсоавт. (1978), эндотелиальная дисфункция диагностируется при значениипоказателя, превышающем 2,77×105 в 1 л плазмы [154]. По данным В.С.Савельева (2010) количество циркулирующих эндотелиоцитов в плазме крови внорме составляет от 2 до 4 клеток в 100 мкл [100]. П.Е. Асташев (2011)предложил выделять степени эндотелиальной дисфункции по количествудесквамированных эндотелиальных клеток [9]: при значениях количества ДЭК от6 до 10 клеток степень повреждения стенок сосудов расценивали как легкую, от11 до 25 - среднюю, а от 26 и выше - как выраженную.

Д.М. Овсяник и соавт.(2014) предложили единовременную окраску цитологического препарата 0,1%раствором метиленового синего, что упрощает работу с цитообъектами в камереГоряева [77]. Л.Г. Краснова с соавт. (2004) предложили усовершенствованныйметод с помощью предварительного создания супрасистолического давления вплече перед забором крови, что позволяет, по данным авторов, выявлять скрытуюдисфункцию эндотелия [83].Определение циркулирующих ДЭК можно проводить с помощью методовиммунофлюоресцентного,цитометрии,иммуноцитохимическогоиммуномагнитнойизоляции.Так,анализа,дляпроточнойидентификацииэндотелиоцитов используют антитела к фактору фон Виллебранда, которыйсинтезируетсяизатемэкспрессируетсянаклеточнойповерхности48эндотелиоцитов.

Однако этот маркер не является строго специфичным дляэндотелиоцитов, так как также синтезируется тромбоцитами [48].А.И. Инжутовой и соавт. (2014) разработан метод микросокпическойрегистрации десквамированных эндотелиоцитов в пересчете на 100 лимфоцитов сопределением коэффициента содержания мембранвысвобожденных микрочастици суммарного титра антител к фосфолипидам и sPECAM-1 [84]. Использованиеметода позволяет определить содержание гуморальных маркеров по регистрациидесквамированных эндотелиоцитов периферической крови.В литературе описывается метод определения антител к рецепторамсосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Антитела к VEGF являютсявысокоспецифическими маркерами ДЭК, так как VEGF отсутствует на другихциркулирующих клетках крови [48].Взарубежныхдифференцированныхисследованияхдляциркулирующихопределенияколичествадесквамированныхзрелыхэндотелиоцитовиспользуется методика CD146-опосредованной иммуномагнитной изоляции.F.Dignat-Georgeисоавт.в2003годуспомощьюиммуномагнитноцитохимического связывания моноклональных антител CD 146 срецепторамидесквамированныхэндотелиоцитовобнаружилиприостромкоронарном синдроме увеличение количества ДЭК до 7,5 клеток /100 мкл плазмы,у здоровых людей среднее количество ДЭК составило менее 3 клеток [147].Влитературныхпрогностическойисточникахценностивстречаютсяцитологическойработыдиагностикипоопределениюэндотелиальнойдисфункции.