Диссертация (Клиническое значение эндотелиальной дисфункции в развитии акушерских и перинатальных осложнений), страница 12

Укаждого пациента считают десять проб по 10 мкл плазмы (всего 100 мкл).Суммируют данные о количестве циркулирующих эндотелиоцитов в 10пробах и определяют их общее количество, выражающееся в единицах на100 мкл плазмы.Определение числа циркулирующих ДЭК осуществлялось в камере Горяевас использованием микроскопа Leika DM 1000 (рисунки 1а-1е).Основным требованием для морфологического анализа в цитологииявляется минимизация толщины препарата, т.е достижение монослоя, прикотором клетки лежат отдельно друг от друга, что возможно при использованиикамеры Горяева.

Камера Горяева – оптическое устройство для подсчета клетокили иных соизмеримых с ними частиц в определенном объёме жидкости. КамераГорява представляет собой прозрачный параллелепипеднанесённоймикроскопическойсеткой,нанесеннойнас бороздами иплощадкустекла,расположенную на 0,1 мм ниже, чем две соседние площадки, необходимые дляпритирания покровного стекла.

Размеры малого квадрата сетки камеры Горяевасоставляют 0,05×0,05 мм. Размеры большого квадрата сетки камеры Горяевасоставляют 0,2×0,2 мм. Объем камеры Горяева 0,9 мм3.Важным критерием служит окраска препарата. При использованной намиметодике цитоплазма ДЭК окрашивается в голубой цвет, а гранулы (ядро илифрагменты ядра) – в синий цвет, благодаря чему, был получен оптимальныйцветовой контраст между цитоплазмой эндотелиоцитов, хроматином и фоном.66а)б)в)г)д)е)Рисунки 1а-1е – Десквамированные эндотелиоциты в камере Горяева.Окраска метиленовый синий. Увеличение 600×.2)Морфоденситометрическоеисследованиедесквамированныхэндотелиоцитов периферической крови.

Используемая методика полученияизображения ДЭК позволяет проводить компьютерную морфоденситометрию67клеток. Цитопрепараты исследовались с применением микросокпа Leika DM 1000с компьютерной видеоприставкой с использованием вычислительной системыобработки и анализа изображений Leika Application Suite LAZ EZ Version 2.1.0.(2012). Алгоритм исследования состоит из нескольких этапов, представляющихединый технологический цикл.

Схема работы с изображением ДЭК включаетследующие этапы:1) Подготовка цитологического препарата ДЭК в камере Горяева.2) Микросокпирование препарата и подготовка поля зрения.3) Съемка препарата с тубуса микроскопа фотокамерой.4) Перенос и сохранение изображения с фотокамеры с использованиемпрограммы для конвертирования файлов.5) Открытие изображения в программе Leika Application Suite LAZ EZVersion 2.1.0.6) Проведение тоновой коррекции для минимизации уровня ошибок,связанных с окраской и освещением.7) Выделение (сегментация) клеток в изображении с последующимконтролем опреатором.8) Проведение измерения параметров клеток.9) Сохранение полученных результатов в электронной таблице.10) Статистический анализ и представление полученных результатов.Введениеформированииизображенияматрицызаключается(растра),оцифровкеэлементывидеосигналакоторойихарактеризуетсяопределенной яркостью.

Выделение цитообъекта включает предобработку исегментацию.улучшенияПредобработкойцветопередачидляназываютоперациипоследующейсизображениемсегментации.дляСегментациязаключается в разделении множества элементов (пикселов) изображения нагруппы, в соответствии с типами выделяемых оптических объектов и дальнейшимобъединении пикселов, соответствующих одному объекту. Процесс сегментацииявляется важным компонентом морфоденситометрического исследования [36],суть которого заключается в фиксации порогового уровня сигнала в зоне68исследовательского интереса (в данном случае: ядро, включая компактный идиффузный хроматин, цитоплазма).

Порог сегментации цитообъекта определялсясогласно оптическим параметрам полученных препаратов. Помимо этого,сегментация необходима для выделения единичных объектов ДЭК и исключениякомпьютерной обработки конгломератов клеток (рисунок 2)Рисунок 2 – Конгломерат десквамированных эндотелиоцитов в камереГоряева. Окраска метиленовый синий. Увеличение 600×.У каждого пациента проводился подсчет количества ДЭК в 10 пробахкамеры Горяева, и определялось среднее значение количества циркулирующихДЭК. Единовременно осуществлялась съемка препарата с тубуса микроскопафотокамерой, перенос и сохранение изображения с использованием программыдля конвертирования файлов.

В автоматическом режиме проводилась тоноваякоррекция изображения для минимизации уровня ошибок, связанных с окраской иосвещением. У каждого пациента проводилась обработка 100 цитообъектов, и вавтоматическомрежимеопределялисьсредниеморфоцитометрическиепараметры ДЭК периферической крови.КомплексморфометрическихпараметровДЭК,автоматическисчитываемых с каждой клетки, включал 5 геометрических характеристик.1.Среднийэквивалентныйдиаметрклетки–расстояниемеждумаксимально удаленными точками (пикселами) оптического объекта на плоскостиD = 2√S/π,(1)где S – площадь клетки.2.Периметр клеткиL = Nb/k,(2)69где Nb - сумма пикселов границы клетки, k - коэффициент линейного разрешения(число пикселов на 1 мкм). ДЭК имеют полигональную форму, и определениепериметра клетки является дополнительным показателем морфометричекойхарактеристики исследуемого цитообъекта.

Величину показателя определяетреальный размер и ровность границы исследуемого объекта.3.Площадь клеткиS = N /k2,(3)где N – сумма пикселов объекта; k – коэффициент линейного разрешения (числопикселов на 1 мкм). Учитывается количество только тех пикселов, которые невыходят за границу цитообъекта.4. Фактор формыF = L2/S,(4)где L – периметр клетки, S – площадь клетки.

Фактор формы –параметризрезанности периметра цитообъекта – безразмерная величина, являющаясякомбинацией характеристик формы и размера клетки. Фактор формы круга равен12,56. Данный параметр морфометрического исследования демонстрируетприближение формы объекта к форме круга.5. ПоляризацияP=2(a-b)/(a+b),(5)где а - наибольшая, b - наименьшая оси оптического объекта. Этот параметрявляется характеристикой эллиптичности оптического объекта, и варьирует от 0до 2. Деструкция эндотелиоцита при десквамации сопровождается потерейокруглойформыдополнительнаяклетки.Данныйморфометрическаяпараметрможетхарактеристикаиспользоватьсякакдеквамированнойэндотелиальной клетки.Для каждого параметра вычислялись его статистические характеристики:среднее, стандартное отклонение, минимум, максимум, медиана, верхний инижний квартиль.

Результаты представлялись в виде гистограмм распределения итаблиц.70Морфометрическое3)исследованиесосудовхориона.Материалисследования – ворсинчатый хорион. Комплексом методик исследованыпрепараты ворсинчатого хориона, полученные при инструментальном аборте насроке беременности 7-10 недель. Критерий выбора срока беременности определенморфологическойособенностьюсосудовтретичныхворсин,которыеформируются к 7 неделе беременности и до гестационного срока 10 недель всоставе своей стенки не содержат перицитов, что обеспечивает исследованиесостояния эндотелия хориона плода, отождествляя толщину стенки фетальногокапилляра с толщиной эндотелиоцита.

Фиксация морфологического материалапроводилась в 10% растворе нейтрального формалине. Осуществлялось описаниегистологических препаратов, после чего отбирались блоки с ворсинчатымхорионом для морфометрического исследования. На ротационном микротомеготовились срезы парафиновых блоков толщиной от 4 до 5 мкм, которыенаклеивались на обезжиренные предметные стекла. После депарафинирования,препаратыокрашивалисьпросветлялисьвгематоксилиномкарбол-ксилолеииэозином,заключалисьвобезвоживались,канадскийбальзам.Исследование гистологических препаратов проводилось с использованиеммикросокопа Leika DM 1000 и компьютерной видеоприставки с вычислительнойсистемой обработки и анализа изображений LeikaApplication Suite LAZ EZVersion 2.1.0.

(2012). С помощью световой микросокпии верифицировалисьсосуды ворсин хориона. Для морфометрии использовались только сосуды счетким поперечным срезом (рисунок 3). В исследовании использованыследующие морфометрические параметры:1. Средняя толщина стенки сосуда.2. Средний диаметр просвета сосуда.3. Средняя площадь просвета сосуда.4. Индекс Керногана – отношение толщины стенки сосуда к диаметрупросвета сосуда.5. Индексапоптозаэндотелиоцитов–отношениеклетоксморфологическими признаками апоптоза к общему количеству71исследуемых клеток. Апоптоз в эндотелиоцитах определялся путемсегментации при морфоденситометрии: фиксация поргового уровнясигнала в зоне плотности ядерного материала позволяла выделятьучастки компактизации, маргинации и фрагментации хроматина сформированиемхроматомеров–денситометрическийпризнакапоптоза клетки.Для каждого параметра вычислялись его статистические характеристики:среднее, стандартное отклонение, минимум, максимум, медиана, нижний иверхний квартиль.

Результаты представлялись в виде гистограмм распределения итаблиц.Рисунок 3 – Сосуд ворсинчатого хориона (9 недель). Окраскагематоксилин-эозин. Увеличение 600×.4) Ультразвуковое исследование органов малого таза у беременных.Проводилось УЗ-исследование с доплерометрией органов малого таза и плодногояйца.2.2.4. Статистическая обработка полученных данныхСтатистическаяобработкаполученныхрезультатоввыполняласьспомощью пакета прикладных программ Statistica 10 и SAS JMP 11 и Excel(Microsoft Office Excel 2003). Определялись такие параметры, как средняяарифметическая величина (М), ошибка средней арифметической (м), отклонение72варианты (v). Сравнение параметрических величин, рассчитанных на основеполученныхвыборокосуществлялосьспомощьюклассическогоt-тестаСтьюдента.