Диссертация (Эффективность лечения «тонкого» эндометрия при маточной форме бесплодия и невынашивании беременности), страница 3

Забор материала проводилсяв транспортную среду «Amies» с углём, доставлялся в лабораторию, высевыпроводились на кровяно-дрожевом агаре и агаре Сабуро. Исследованиявыполнялись«УральскийвотделенииНИИохраныбиохимическихматеринстваметодовиисследованиямладенчества»ФГБУМинистерстваздравоохранения РФ (руководитель - кандидат медицинских наук ПестряеваЛюдмила Анатольевна).Иммуноферментный анализ.

Функциональные характеристики эндотелия имаркёровангиогенезавпериферическойкровиоценивалиметодомиммуноферментного анализа (ИФА). Детекцию проводили на иммуноферментныханализаторах «Wallac 1420 (Victor2)» фирмы «PerkinElmer» (Финляндия) и«Multiskan МСС/340» фирмы Labsystems (Финляндия).Уровень васкуло-эндотелиального фактора роста (VEGF) и рецептора кнему(sVEGF-R1)определялиспомощьюкоммерческихтест-систем«BenderMedsystems» (Австрия). Концентрацию эндотелина-1 – с использованиемнаборов фирмы «Biomedica» (Австрия).

Концентрациюметаболитов NO(эндогенного нитрита – NO3, общего нитрита – NO2 и нитрата – NO3) оценивалиспектрофотометрическим способом, в основе которого лежит превращениенитрата в нитрит с участием нитрат-редуктазы в реакции Грисса, а такжеопределение содержания ангиогенина проводили с помощью тест-систем «RDSystems»(США).Исследованиепроводиливотделениииммунологии,микробиологии, патоморфологии и цитодиагностики ФГБУ «Уральский НИИохраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения РФ(руководитель - доктор медицинских наук, профессор Гузель Нуховна Чистякова).Ультразвуковое исcледование проводили на аппарате Hawk 2102 EXLUltrasoundScanner(Denmark)сиспользованиеммультичастичногоабдоминального датчика с частотой 3,5-5 МГц и 5МГц и вагинального датчика 7МГц.

При исследовании оценивались размеры матки и придатков, однородностьэндометрия, отсутствие патологических включений и синехий в полости матки.ОпределяласьтолщинаМ-эхо,трёхслойностьструктурыэндометрия.15Исследование проводили на ЛГ+7 день менструального цикла. Исследованиепроводили в отделении биофизических и лучевых методов исследования ФГБУ«УральскийНИИохраныматеринстваимладенчества»Министерстваздравоохранения РФ (руководитель - кандидат медицинских наук КосовцоваНаталья Владимировна).Гистологическое исследование эндометрия. Образцы эндометрия, взятыедля гистологического исследования на ЛГ+7 день менструального цикла методомpipelle-биопсии, фиксировали в 10% нейтральном формалине, далее фиксировалив парафин, делали тонике срезы не более 5 мкм и окрашивали эозином игематоксилином.Оценивалась макро- и микроскопическая морфометрическая картинаэндометрия (состояние стромы, железистого аппарата, соответствие эндометрияфазе менструального цикла, развитие сосудов стромы эндометрия).

Проводиласьдиагностика структурных изменений воспалительного характера, нарушенийкровоснабжения и микроциркуляции, а также атрофических изменений висследуемых образцах эндометрия.Исследование проводили в отделении иммунологии, микробиологии,патоморфологии и цитодиагностики ФГБУ «Уральский НИИ охраны материнстваи младенчества» Министерства здравоохранения РФ (руководитель - доктормедицинских наук, профессор Гузель Нуховна Чистякова).Иммуногистохимическое исследование эндометрия.

Эндометрий дляисследования был взят на ЛГ+7 день менструального цикла. Определялисостояние рецепторного аппарата, локального иммунитета, пролиферативнойактивности, ангиогенеза, рецептивности эндометрия.Для иммуногистохимического исследования применяли двухэтапныйстрептавидин-биотин-пероксидазныйметодсдемаскировкойантигенаииспользованием стандартных наборов моноклональных и поликлональныхантител фирмы «Bond RTU Primary», США и «DAКO», Дания.

При помощисистемы визуализации «Dako Cytomation» осуществляли проявление реакции.Безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System16(Biogenex) применяли для визуализации первичных антител.Для иммуногистохимического исследования использовали серийныепарафиновыесрезы.Дляиммуногистохимическихреакцийобрабатывалипарафиновые срезы по традиционной методике с использованием мышиныхмоноклональныхантителкэстрогеновымрецепторам-α(клон6F-11),прогестероновым рецепторам (клон 16), а также к антигенам лимфоцитов CD3+(клон LN10), CD20+ (клон MJ1).Экспрессию рецепторов к эстрогенам и прогестеронам оценивали по 3балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени).

Для анализа результатовИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS=1a+2b+3c, где а – % слабо окрашенных клеток, b – % умеренно окрашенныхклеток, с – % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания,выраженная в баллах.Экспрессию CD3 (клон LN10, США), CD20 (клон MJ1, США), CD138(поликлональные, США) оценивали в поле зрения при увеличении 400 путемподсчета позитивных клеток при подсчете не менее 10 полей.Экспрессию CD34 (клон QBEnd/10, Дания) и VEGF (поликлональные,Дания) определяли в эпителии, строме эндометрия и эндотелии сосудов.Активность проявлялась в виде окрашивания мембраны и цитоплазмыэпителиальных и эндотелиальных клеток.Экспрессию LIF (поликлональные, США), LIFR (поликлональные, США)определяли на мембранах клеток поверхностного эпителия желез эндометрияпутем подсчета в поле зрения количества окрашенных клеток при увеличении400.Исследование проводили в отделении иммунологии, микробиологии,патоморфологии и цитодиагностики ФГБУ «Уральский НИИ охраны материнстваи младенчества» Министерства здравоохранения РФ (руководитель - доктормедицинских наук, профессор Гузель Нуховна Чистякова).Ультраструктурное исследование эндометрия.

Исследовали образцыэндометрия, взятые методом pipelle-biopsia в период предполагаемого «окна17имплантации» (ЛГ+7), соответствующего 20-22 дню 28-дневного менструальногоцикла.Материал помещали в контейнер Эппендорфа с фосфатным буфером 1,0мл и транспортировали при t 37.0°С в лабораторию.Дляисследованиявтрансмиссионномэлектронноммикроскопеэндометрий центрифугировали на протяжении получаса при температуре 37°С с2.5% раствором глютарового альдегида.

Центрифуга работала в режиме: 15 минпри 1000 об\мин.Далее материал промывали фосфатным буфером, фиксировали 1%осмиевой кислотой на фосфатном буфере, далее обезвоживали в спиртах. Послепроводилась полимеризация в течении суток при 37°С и далее ещё сутки притемпературе 56°С. Самые тонкие образцы эндометрия делали на ультрамикротомеUltraCutl 11, потом проводили окраску цитратом свинца (MiHonig, 1961) иисследовали в электронном микроскопе JEM 100S.Оценивались наличие пиноподий, плотность их распространения, степеньих развития в соответствие с фазой менструального цикла, акселерация илигипоплазияпиноподий,наличиегетероморфностисекреторныхклеток,морфология ресничных клеток, плотность межклеточных контактов.Ультраструктурное исследование эндометрия проводили совместно с«Московским государственным университетом имени М.В.Ломоносова», НИИфизико-химической биологии имени А.Н.

Белозерского (директор – академикРАН Скулачев В.П.)Положения, выносимые на защиту:1.Предпосылкой формирования «тонкого» эндометрия у женщин сматочной формой бесплодия и невынашиванием беременности следует считатьего ятрогенное механическое повреждение, которое приводит к развитиювоспалительного ответа с исходом в хронический эндометрит (р<0,05), а вдальнейшем - в гипоплазию эндометрия.2.Морфологическими маркёрами «тонкого» эндометрия являютсядисхроноз созревания желёз эндометрия, обеднение сосудистой сети, уплотнение18стромального компонента; его ультраструктурными маркёрами следует считатьасинхронность и акселерацию созревания пиноподий, плотные межклеточныеконтакты,гладкуюапикальнуюповерхностьиатипичныеклеткимикроокружения; иммуногистохимическими маркёрами являются снижениеэкспрессии LIF, LIF-R, CD34, VGEF A (р<0,05), увеличение экспрессии CD3+,CD20+, CD138+ в строме и железах эндометрия (р<0,05).Включение в состав комплексной терапии орошения полости матки3.кавитированными растворами у пациенток с бесплодием и невынашиваниембеременности,обусловленными«тонким»эндометрием,снижаетчастотухронического эндометрита (на 80,00% в группе с бесплодием и на 76,94% вгруппе с невынашиванием, р<0,05), приводит к элиминации патогенной иусловно-патогенной микрофлоры из половых путей (у 100% пациенток сбесплодием и у 97,72% с невынашиванием беременности), восстанавливаетморфологическую структуру эндометрия и показатели его рецептивности(р<0,05).Комплексный4.методлечения,включающийультразвуковоекавитационное орошение полости матки, по сравнению со стандартной терапией в2,2 раза эффективнее способствует восстановлению рецептивности эндометрия(p<0,05) и позволяет более результативно (p<0,05) улучшить репродуктивныеисходыупациентоксбесплодиеминевынашиваниембеременности,обусловленными «тонким» эндометрием (самопроизвольная беременность –76,47% и 80,00%, против 66,67%; срочные роды – 88,24% и 85,71%, против44,44%).Степень достоверности и апробация работы.

Обработка полученныхрезультатов статистическими методами проводилась с использованием пакетовприкладных программ «Statisticafor Windows 6.0» (Stat Soft, США) и «MicrosoftExcel» (2007), а также при помощи программы IBM SPSS Statistics 22.Полученные данные представлялись в виде средней величины (М) истандартной ошибки средней (m), если распределение признакаподчинялосьзакону нормального распределения.