Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 7

PDF-файл Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 7 Биология (47812): Диссертация - Аспирантура и докторантураДиссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения) - PDF, страница 7 (472019-06-29СтудИзба

Описание файла

Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения". PDF-файл из архива "Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

Просмотр PDF-файла онлайн

Текст 7 страницы из PDF

Культивирование В-клеточных линийВ работе были использованы линии клеток Namalva и U266, полученные изКоллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург,Россия). Клетки выращивали в среде IMDM с добавлением 7% сывороткиэмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия).382.3. Дифференцировка МСКПри изучении способности МСК к адипогенной дифференцировке ккультурам,достигшим70-80%конфлюэнтности,добавляли0,2мМиндометацина, 0,5 мМ дексаметазона и 1 мкМ изобутилметилксантина(“Sigma”).

При смене среды каждые 3-4 сут использовали ростовую среду,содержавшую 10 мкМ инсулина (“Sigma”). Присутствие адипоцитов вкультурах МСК выявляли через 3 нед окрашиванием жировым красным О(“Bio-Optica”). В качестве контроля использовали МСК тех же образцов ипассажей, культивированные в стандартной ростовой среде без добавлениядифференцировочных стимулов.Остеогенную дифференцировку МСК индуцировали при достижении 6070% конфлюэнтного монослоя, добавляя к ростовой среде 0,1 мкМдексаметазона, 0,2 мМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты и 10 мМ глицерол-2фосфата (“Chemicon”).

Результаты оценивали через 2-3 нед по окрашиваниюотложений кальция в остеоцитах ализариновым красным С (“Chemicon”).Контролем служили МСК тех же эксплантаций и пассажей, культивированныев стандартной ростовой среде.Дифференцировку клеток в хондрогенном направлении производили сиспользованиемChondrogenesisкоммерческойDifferentiationсредыKitдля(Gibco)дифференцировкисогласноStemPro®рекомендованномупротоколу.2.4.

Морфологическая характеристика МСКМорфологическую характеристику МСК проводили с помощью программыCapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения,полученных с использованием светового инвертированного микроскопаAxiovert 40C, оснащенного системой анализа изображения Progress CT3 (Zeiss,Германия). Определение среднего размера клеток проводили для МСК, снятых39с подложки во время пассирования культуры, с помощью автоматическогоклеточного счетчика Beckman Coulter (США).2.5. Определение пролиферативной активности МСККоличествоижизнеспособностьМСКопределялиспомощьюавтоматического клеточного счетчика Beckman Coulter (США). Среднее времяудвоения популяции Td расчитывали по формуле Td=(log22)*t/(log2(Nt/N0)), гдеt – время прироста популяции, Nt – количество клеток через время t, N0 –исходное количество клеток.2.6.

Иммунофенотипирование культур МСКПоверхностные маркеры мезенхимных стволовых клеток выявляли спомощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD45, CD90,CD105,CD73,цитофлуориметреинструкциейCD13,FC500CD10,CD44,(Beckmanпроизводителя.ДляCD14,Coulter,этогоCD117США)культурывнапроточномсоответствииМСКсснималипоследовательно 0,02% раствором Версена и 0,25% раствором трипсина.Действие раствора трипсина останавливали внесением ФСР с 10% заменителясыворотки. Полученную суспензию дважды отмывали ФСР и суспендировали в200 мкл ФСР для последующего анализа на проточном цитофлуориметре.Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспеченияСХР.2.7. Получение и активация клеток мононуклеарной фракции кровиВ исследовании использовали образцы венозной крови 8 здоровых доноров,а также 16-ти доноров-добровольцев, в анамнезе которых были зафиксированыклиническиепроявленияатопическийдерматит,гиперчувствительности(аллергическийостраягастроэнтерологическиекрапивница,ринит,расстройства, атопическая бронхиальная астма, анафилаксия).

В 4-х случаяхреакции развивались после приема пищевых продуктов, в 3-х – после40применения лекарственных препаратов, в остальных – после контакта сбытовыми и с пыльцевыми аллергенами (4 и 5 случаев соответственно). Вседоноры в момент сбора образцов крови находились в состоянии ремиссии и неимели клинических проявлений аллергических реакций.Полученные образцы гепаринизированной крови наслаивали на градиентфиколла (ρ=1,077, Биолот, Россия), центрифугировали (400 G, 7 мин) исобирали лейкоцитарную фракцию, которую после отмывания в ФСР,суспендировали в ростовой среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки(HyClone, Н.Зеландия). Клеточный состав лейкоцитарной фракции определялис помощью гематологического анализатора Beckman-Coulter ACT Diff2 (США).2.8.

Выделение популяции В-лимфоцитов из образцов мононуклеарнойфракции крови.Получение популяции В-лимфоцитов (CD45+CD19+) проводили с помощьюиммунномагнитной сепарации с использованиемпарамагнитных частиц,покрытых антителами к CD19 (CD19 MicroBeads), колонок MS (MS Column), исепаратора MiniMACS™ (Miltenyi Biotec, Германия) согласно инструкциипроизводителя. По данным проточной цитофлуорометрии, чистота выделенияфракции В-лимфоцитов составляла 97,5 ±1,9 %.2.9.СокультивированиеМСКиклетокмононуклеарнойфракциипериферической кровиМСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыс кл/см2, через 24 чв те же ячейки вносили равное количество клеток лейкоцитарных фракций.Также использовали соотношения МСК и клеток мононуклеарных фракций1:10 и 1:100.

Растворы аллергенов, либо ЛПС (до конечной концентрации 10нг/мл), либо ФГА (до конечной концентрации 10 нг/мл) вносили одновременнос началом сокультивирования МСК и клеток лейкоцитарных фракций.Сокультивирование проводили в среде RPMI с 10% фетальной бычьейсыворотки (HyClone, Н.Зеландия).41После сокультивирования МСК и клеток мононуклеарной фракции втечение предусмотренного задачей эксперимента времени (3 ч, 24 ч или 72 ч)из лунок отбирали всю культуральную среду с неприкрепленными клетками ицентрифугировали (5 минут, 400 G).

Полученный концентрат клетокмононуклеарнойфракциианализировалиметодомпроточнойцитофлуорометрии, а культуральную среду переносили в новые пробирки дляиммуноферментного анализа концентрации цитокинов и иммуноглобулинов.Затем, чтобы учесть в анализе клетки мононуклеарной фракции, которыеприкрепились к МСК, лунки дважды промывали ФСР, центрифугировали (5мин, 400G) и полученный осадок объединяли с полученным раннееконцентратом клеток из соответствующей лунки. Все эксперименты былипоставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника.2.10. Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266МСК рассевали в лунки 6-ти луночного планшета в концентрации 10 или 60тыс кл/см2 в зависимости от требуемой плотности культуры. Перед началомсокультивирования c помощью инвертированного микроскопа оценивалистепень конфлюентности МСК.

Через сутки в лунки с МСК вносили клеткилинииNamalvaлиболинииU266вравносоотношениисМСК.Сокультивирование в обоих случаях проводили в среде IMDM с добавлением 7% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) в течение 72 ч.Контролем служили клетки линий Namalva и U266, культивируемые без МСК.Все эксперименты были поставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК изкаждого источника.2.11. Оценка пролиферации лимфоцитовОпределение количества делений лимфоцитов проводили с помощьюокраски витальным красителем карбоксифлуоресцеин сукцинимидным эфиром(Carboxyfluorescein succinimidyl ester – CFSE) и оценивали по редукции егофлуоресценции методом проточной цитометрии после сокультивирования с42МСК. Для этого перед сокультивированием с МСК клетки мононуклеарнойфракции или В-лимфоциты окрашивали красителем CFSE.

Для окрашивания1×106 клеток мононуклеарной фракции ресуспендировали в 1 мл культуральнойсреды RPMI-1640 и добавляли CFSE до конечной концентрации 5 μM. Затемсуспензию инкубировали 5 мин в темноте при комнатной температуре.Реакцию окрашивания останавливали путем добавления охлажденной до +4 оСполной культуральной среды RPMI-1640 с последующими повторнымцентрифугированием (400g, 5 мин). После проведения окрашивания осадокклеток ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI-1640, добавлялистимулирующий агент (ФГА для стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов,ЛПС – В-лимфоцитов) и вносили в лунки, содержащие МСК, либо без МСК(контроль).

После окончания культивирования лимфоциты собирали, отмывалии ресуспендировали в 200 мкл ФСР для анализа на проточном цитометре постандартной методике (Suva D. et al., 2007). Все эксперименты былипоставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника.2.12. Иммунофенотипирование лимфоцитовС помощью проточной цитофлуорометрии выявляли популяции Bлимфоцитов (CD19+), естественных киллеров (CD3-, CD16+, CD56+), Тлимфоцитов (CD3+, CD4+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+, HLA-DR+), атакже регуляторных Т- клеток (CD3+, CD4+, CD127low) и Т-лимфоцитов,экспрессирующихранниймаркерактивации(CD3+,CD69+).Клеткиокрашивали меченными флуорохромами антителами в течение 20 минут втемноте при комнатной температуре.

Использовали реагенты фирмы BeckmanCoulter, США. Анализ выполняли на проточном цитофлуориметре FC500 сдлиной волны лазерного излучения 488 нм и программным обеспечением CXPв соответствии с инструкцией производителя (Beckman Coulter, США).432.13. Иммуноферментный анализОпределение концентрацииIgE и цитокинов IL-4, IL-10, IL-6вкультуральной среде проводили методом твердофазного иммуноферментногоанализа (ИФА). Для этого по окончанию сокультивирования МСК илимфоцитов отбирали культуральную среду, отмечали ее объем и количествоклеток. Собственно для анализа использовали 100 мкл. Постановку реакциипроводили с помощью коммерческих наборов (Вектор-Бест, Россия) согласноинструкции производителя.

Измерение оптической плотности выполняли напланшетном спектрофотометре Anthos 2020 или Мультискан FC. Длякачественного определения рассчитывали значение критической оптическойплотности (границы между положительным и отрицательным результатами) поформуле, указанной в инструкции. Для количественного определенияконцентрации строили калибровочную кривую согласно инструкции.2.14. Оценка уровня продукции иммуноглобулинов в В-клеточных линияхОценку уровня продукции иммуноглобулинов проводили с помощьюпроточной цитофлуорометрии с окраской иммуноглобулинов меченнымифлуоресцеином моноклональными антителами.

Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
5288
Авторов
на СтудИзбе
417
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее