Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 7

Культивирование В-клеточных линийВ работе были использованы линии клеток Namalva и U266, полученные изКоллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург,Россия). Клетки выращивали в среде IMDM с добавлением 7% сывороткиэмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия).382.3. Дифференцировка МСКПри изучении способности МСК к адипогенной дифференцировке ккультурам,достигшим70-80%конфлюэнтности,добавляли0,2мМиндометацина, 0,5 мМ дексаметазона и 1 мкМ изобутилметилксантина(“Sigma”).

При смене среды каждые 3-4 сут использовали ростовую среду,содержавшую 10 мкМ инсулина (“Sigma”). Присутствие адипоцитов вкультурах МСК выявляли через 3 нед окрашиванием жировым красным О(“Bio-Optica”). В качестве контроля использовали МСК тех же образцов ипассажей, культивированные в стандартной ростовой среде без добавлениядифференцировочных стимулов.Остеогенную дифференцировку МСК индуцировали при достижении 6070% конфлюэнтного монослоя, добавляя к ростовой среде 0,1 мкМдексаметазона, 0,2 мМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты и 10 мМ глицерол-2фосфата (“Chemicon”).

Результаты оценивали через 2-3 нед по окрашиваниюотложений кальция в остеоцитах ализариновым красным С (“Chemicon”).Контролем служили МСК тех же эксплантаций и пассажей, культивированныев стандартной ростовой среде.Дифференцировку клеток в хондрогенном направлении производили сиспользованиемChondrogenesisкоммерческойDifferentiationсредыKitдля(Gibco)дифференцировкисогласноStemPro®рекомендованномупротоколу.2.4.

Морфологическая характеристика МСКМорфологическую характеристику МСК проводили с помощью программыCapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения,полученных с использованием светового инвертированного микроскопаAxiovert 40C, оснащенного системой анализа изображения Progress CT3 (Zeiss,Германия). Определение среднего размера клеток проводили для МСК, снятых39с подложки во время пассирования культуры, с помощью автоматическогоклеточного счетчика Beckman Coulter (США).2.5. Определение пролиферативной активности МСККоличествоижизнеспособностьМСКопределялиспомощьюавтоматического клеточного счетчика Beckman Coulter (США). Среднее времяудвоения популяции Td расчитывали по формуле Td=(log22)*t/(log2(Nt/N0)), гдеt – время прироста популяции, Nt – количество клеток через время t, N0 –исходное количество клеток.2.6.

Иммунофенотипирование культур МСКПоверхностные маркеры мезенхимных стволовых клеток выявляли спомощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD45, CD90,CD105,CD73,цитофлуориметреинструкциейCD13,FC500CD10,CD44,(Beckmanпроизводителя.ДляCD14,Coulter,этогоCD117США)культурывнапроточномсоответствииМСКсснималипоследовательно 0,02% раствором Версена и 0,25% раствором трипсина.Действие раствора трипсина останавливали внесением ФСР с 10% заменителясыворотки. Полученную суспензию дважды отмывали ФСР и суспендировали в200 мкл ФСР для последующего анализа на проточном цитофлуориметре.Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспеченияСХР.2.7. Получение и активация клеток мононуклеарной фракции кровиВ исследовании использовали образцы венозной крови 8 здоровых доноров,а также 16-ти доноров-добровольцев, в анамнезе которых были зафиксированыклиническиепроявленияатопическийдерматит,гиперчувствительности(аллергическийостраягастроэнтерологическиекрапивница,ринит,расстройства, атопическая бронхиальная астма, анафилаксия).

В 4-х случаяхреакции развивались после приема пищевых продуктов, в 3-х – после40применения лекарственных препаратов, в остальных – после контакта сбытовыми и с пыльцевыми аллергенами (4 и 5 случаев соответственно). Вседоноры в момент сбора образцов крови находились в состоянии ремиссии и неимели клинических проявлений аллергических реакций.Полученные образцы гепаринизированной крови наслаивали на градиентфиколла (ρ=1,077, Биолот, Россия), центрифугировали (400 G, 7 мин) исобирали лейкоцитарную фракцию, которую после отмывания в ФСР,суспендировали в ростовой среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки(HyClone, Н.Зеландия). Клеточный состав лейкоцитарной фракции определялис помощью гематологического анализатора Beckman-Coulter ACT Diff2 (США).2.8.

Выделение популяции В-лимфоцитов из образцов мононуклеарнойфракции крови.Получение популяции В-лимфоцитов (CD45+CD19+) проводили с помощьюиммунномагнитной сепарации с использованиемпарамагнитных частиц,покрытых антителами к CD19 (CD19 MicroBeads), колонок MS (MS Column), исепаратора MiniMACS™ (Miltenyi Biotec, Германия) согласно инструкциипроизводителя. По данным проточной цитофлуорометрии, чистота выделенияфракции В-лимфоцитов составляла 97,5 ±1,9 %.2.9.СокультивированиеМСКиклетокмононуклеарнойфракциипериферической кровиМСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыс кл/см2, через 24 чв те же ячейки вносили равное количество клеток лейкоцитарных фракций.Также использовали соотношения МСК и клеток мононуклеарных фракций1:10 и 1:100.

Растворы аллергенов, либо ЛПС (до конечной концентрации 10нг/мл), либо ФГА (до конечной концентрации 10 нг/мл) вносили одновременнос началом сокультивирования МСК и клеток лейкоцитарных фракций.Сокультивирование проводили в среде RPMI с 10% фетальной бычьейсыворотки (HyClone, Н.Зеландия).41После сокультивирования МСК и клеток мононуклеарной фракции втечение предусмотренного задачей эксперимента времени (3 ч, 24 ч или 72 ч)из лунок отбирали всю культуральную среду с неприкрепленными клетками ицентрифугировали (5 минут, 400 G).

Полученный концентрат клетокмононуклеарнойфракциианализировалиметодомпроточнойцитофлуорометрии, а культуральную среду переносили в новые пробирки дляиммуноферментного анализа концентрации цитокинов и иммуноглобулинов.Затем, чтобы учесть в анализе клетки мононуклеарной фракции, которыеприкрепились к МСК, лунки дважды промывали ФСР, центрифугировали (5мин, 400G) и полученный осадок объединяли с полученным раннееконцентратом клеток из соответствующей лунки. Все эксперименты былипоставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника.2.10. Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266МСК рассевали в лунки 6-ти луночного планшета в концентрации 10 или 60тыс кл/см2 в зависимости от требуемой плотности культуры. Перед началомсокультивирования c помощью инвертированного микроскопа оценивалистепень конфлюентности МСК.

Через сутки в лунки с МСК вносили клеткилинииNamalvaлиболинииU266вравносоотношениисМСК.Сокультивирование в обоих случаях проводили в среде IMDM с добавлением 7% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) в течение 72 ч.Контролем служили клетки линий Namalva и U266, культивируемые без МСК.Все эксперименты были поставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК изкаждого источника.2.11. Оценка пролиферации лимфоцитовОпределение количества делений лимфоцитов проводили с помощьюокраски витальным красителем карбоксифлуоресцеин сукцинимидным эфиром(Carboxyfluorescein succinimidyl ester – CFSE) и оценивали по редукции егофлуоресценции методом проточной цитометрии после сокультивирования с42МСК. Для этого перед сокультивированием с МСК клетки мононуклеарнойфракции или В-лимфоциты окрашивали красителем CFSE.

Для окрашивания1×106 клеток мононуклеарной фракции ресуспендировали в 1 мл культуральнойсреды RPMI-1640 и добавляли CFSE до конечной концентрации 5 μM. Затемсуспензию инкубировали 5 мин в темноте при комнатной температуре.Реакцию окрашивания останавливали путем добавления охлажденной до +4 оСполной культуральной среды RPMI-1640 с последующими повторнымцентрифугированием (400g, 5 мин). После проведения окрашивания осадокклеток ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI-1640, добавлялистимулирующий агент (ФГА для стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов,ЛПС – В-лимфоцитов) и вносили в лунки, содержащие МСК, либо без МСК(контроль).

После окончания культивирования лимфоциты собирали, отмывалии ресуспендировали в 200 мкл ФСР для анализа на проточном цитометре постандартной методике (Suva D. et al., 2007). Все эксперименты былипоставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника.2.12. Иммунофенотипирование лимфоцитовС помощью проточной цитофлуорометрии выявляли популяции Bлимфоцитов (CD19+), естественных киллеров (CD3-, CD16+, CD56+), Тлимфоцитов (CD3+, CD4+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+, HLA-DR+), атакже регуляторных Т- клеток (CD3+, CD4+, CD127low) и Т-лимфоцитов,экспрессирующихранниймаркерактивации(CD3+,CD69+).Клеткиокрашивали меченными флуорохромами антителами в течение 20 минут втемноте при комнатной температуре.

Использовали реагенты фирмы BeckmanCoulter, США. Анализ выполняли на проточном цитофлуориметре FC500 сдлиной волны лазерного излучения 488 нм и программным обеспечением CXPв соответствии с инструкцией производителя (Beckman Coulter, США).432.13. Иммуноферментный анализОпределение концентрацииIgE и цитокинов IL-4, IL-10, IL-6вкультуральной среде проводили методом твердофазного иммуноферментногоанализа (ИФА). Для этого по окончанию сокультивирования МСК илимфоцитов отбирали культуральную среду, отмечали ее объем и количествоклеток. Собственно для анализа использовали 100 мкл. Постановку реакциипроводили с помощью коммерческих наборов (Вектор-Бест, Россия) согласноинструкции производителя.

Измерение оптической плотности выполняли напланшетном спектрофотометре Anthos 2020 или Мультискан FC. Длякачественного определения рассчитывали значение критической оптическойплотности (границы между положительным и отрицательным результатами) поформуле, указанной в инструкции. Для количественного определенияконцентрации строили калибровочную кривую согласно инструкции.2.14. Оценка уровня продукции иммуноглобулинов в В-клеточных линияхОценку уровня продукции иммуноглобулинов проводили с помощьюпроточной цитофлуорометрии с окраской иммуноглобулинов меченнымифлуоресцеином моноклональными антителами.