Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 4

Помнению большинства авторов, МСК выделенные из костного мозга, жировойткани и пупочного канатика обладают сходным иммунофенотипом побольшинству маркеров. При этом, в основном, имеется в виду доля клеток впопуляции, экспрессирующих тот или иной маркер. В тоже время описаны20иммунофенотипические различиямежду культурамиМСКизразныхисточников (Zuk et al., 2002). Более того, было показано наличие зависимостиуровня экспрессии антигенов на поверхности МСК костного мозга от возрастаи пола доноров. Так, плотность антигенов CD90, CD106, CD140b, CD146,CD166 и CD274, экспонированных на поверхности отдельных клеток, быловыше в культурах, полученных от молодых доноров по сравнению скультурами от пожилых доноров.

При этом не было показано корреляциимежду возрастом и морфологическими (размер клеток), а также кинетическимихарактеристиками (скорость деления) МСК (Siegel et al, 2013). С другойстороны, не меньшее влияние могут оказывать условия культивирования МСК,в частности, степень конфлюентности и пассаж, на котором находитсякультура, а также концентрация кислорода в процессе культивирования (Halfonet al., 2010).

Таким образом, учитывая разницу в протоколах культивирования идизайна экспериментов, пока нельзя сделать вывод, что оказывает наибольшеевлияние на фенотип МСК: условия культивирования или характеристикиисточника МСК. Тем не менее, наличие зависимости характеристик МСК оттканевойпринадлежностииусловийкультивированияобязываетисследователей проводить тщательное описание используемых в работекультур МСК, особенно для их клинического применения.1.3. Проявления функциональной активности МСК по отношению к ТлимфоцитамОдним из наиболее активно изучаемых свойств МСК является ихспособность оказывать влияние на функциональную активность клетокиммунной системы.

Показано, что МСК способны взаимодействоватьпрактически со всеми компонентами иммунной системы, включая факторыврожденного и приобретенного иммунитета (Рис.1.2.).21Рисунок 1.2. Схема взаимодействия МСК и клеток иммунной системы.Цитировано по Ben-Ami с соавторами, 2011.ВпервыеспособностьиммунокомпетентныхклетокМСКвлиятьбылапоказанананафункцонированиепримереподавленияпролиферативной активности Т-лимфоцитов в присутствии МСК (Bartholomewetal., 2002; Di Nicola et al., 2002). В ходе дальнейших многочисленныхисследований получены данные, что МСК могут воздействовать на процессы,происходящие на каждом из этапов Т-клеточного ответа.МСК способны модулировать активацию Т-лимфоцитов (Le Blanc et al.,2004, Андреева и др., 2013), которая предшествует и сопровождаетпоследующие изменения их функционального состояния.

Активация Тлимфоцитов является результатом сигнального каскада в ответ на связываниеантигена с комплексом TcR (T-клеточный рецептор) и CD3, а также скостимуляторными молекулами. Этот процесс сопровождается экспрессией наповерхности клеток ряда молекул, названных маркерами активации. Выделяютранние и поздние маркеры активации Т-лимфоцитов.22Наиболее ранним маркером активации Т-лимфоцитов является СD69 – онначинает экспрессироваться в течение первых 4 часов после контакта сантигеном (D’Ambrosio et al., 1993). CD69 относится к лектинам C типа и былизначально описан как костимуляционная молекула Т-клеточной активации ипролиферации (Ziegler et al., 1994), стимулирующая продукцию IL-2 и егорецептора (CD25) (Testi et al., 1989), а также TNF-α в Т-лимфоцитах (Santis etal., 1992).

В последующие годы были получены данные, согласно которым, взависимости от факторов микроокружения, CD69 может функционироватьтакже как регуляторная молекула. При этом основным механизмом являетсяиндукция синтеза TGFβ, происходящая вследствие активации CD69 (Esplugueset al., 2003). TGFβ способен ингибировать дифференцировку Т-хелперов в Тхелперы 1 типа или 2 типа в зависимости от факторов микроокружения (Holteret al., 1994), подавлять продукцию IgA В-клетками (Gorelik et al., 2002; Cazac,Roes, 2000). Как костимуляционная молекула CD69 функционирует, еслихарактер ее экспрессии носит кратковременный и индуцибельный характер.Постоянно экспрессирующийся CD69 оказывает ингибирующее действие нареализацию эффекторных функций Т- и В-лимфоцитов.

Например, приактивацииCD69происходитснижениепродукциипровоспалительныхцитокинов IL-17 и IFNγ (Sancho et al., 2003; Radulovic et al., 2012; Martín et al.,2010). В связи с этим уровень экспрессии CD69 может иметь важноефизиологическое значение при разрешении воспалительной реакции либо впроцессе хронического воспаления.В работах разных групп исследователей было показано как стимулирующее(Ramasamy et al., 2008; Saldanha-Araujo et al., 2012), так и ингибирующеевлияние МСК на экспрессию ранних маркеров активации Т-лимфоцитов,включая CD69 (Groh et al., 2005; Le Blanc et al., 2004; Cappellesso-Fleury et al.,2010).

С одной стороны расхождение в результатах может быть объясненометодическими причинами: активированные Т-лимфоцитов преимущественноприкреплены к поверхности МСК (Quaedackers et al., 2009), за счет чего онипрактически не обнаруживаются среди клеток в супернатанте, который чаще23всего используют для анализа субпопуляционного состава лимфоцитов.

Болееважным представляется анализ изменения содержания CD69+ в присутствииМСК в зависимости от параметров экспериментальных систем, включая времяот предъявления стимулирующего агента и начала сокультивирования, а такжеприроды стимулирующего агента.Поздним маркером активации Т-лимфоцитов является HLA-DR молекула главного комплекса гистосовместимости II класса, которая начинаетэкспрессироваться через 24-48 часов после контакта со стимулирующимагентом. Молекула HLA-DR вовлечена в процесс презентации антигена, иактивированные Т-лимфоциты, начинающие экспрессировать поздние маркерыактивации,втомнепрофессиональныечислеHLA-DR,могутантиген-презентирующиефункционироватьклетки,какдополнительноусиливая иммунный ответ (Ebert et al.,, 2005).

Относительное содержание HLADR+ Т-лимфоцитов в крови здоровых доноров не превышает 5,8% (Хайдуков идр., 2009). Повышение содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих поздниймаркер активации HLA-DR, сопровождает течение иммунопатологическихпроцессовразличнойэтиологии.Например,значительноеповышениесодержания CD3+ HLA-DR+ клеток было показано у пациентов с болезньюКрона (Alkim et al., 2012), а также с атопическим дерматитом (Antunez et al.,2006) и атопической бронхиальной астмой (Corrigan et al., 1990). Вэкспериментальных системах in vitro наблюдали, что МСК могут подавлятьиндуцированное ФГА или антителами к CD3 и CD28 увеличение содержанияТ-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR (Буравкова и др., 2011; Kronsteineret al., 2011).Не смотря на наличие разногласий относительно влияния МСК на процессыактивации Т-лимфоцитов, подавление их пролиферации в смешанной культурес МСК являестся хорошо известным и подробно описанным феноменом.Ингибирование пролиферации Т-лимфоцитов не имеет иммунологическихограничений и наблюдается в смешенной культуре как с аутологичными, так и24с аллогенными МСК (Krampera et al., 2003).

Кроме того, МСК одинаковоэффективно подавляют пролиферацию как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов, атакже антиген-специфичных Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти (Le Blanc et al.,2004, Krampera et al., 2006). В присутствии МСК снижается экспрессия циклинаD, что приводит к остановке клеточного цикла активированных Т-клеток на G1фазе (Glennie et al., 2005). Реализация иммуносупрессивного действия МСК наТ-лимфоциты осуществляется с помощью паракринных факторов, а также врезультате прямого межклеточного взаимодействия между ними.

На рольключевых медиаторов, участвующих в этом процессе, предложено несколькобиологически активных веществ: простагландин Е2 (ПГЕ2), оксид азота (NO),TGFβ, белок хемотаксиса моноцитов 1 (МСР-1/CCL2), лейкоцитарный антигенчеловека G (HLA G), индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО) (English et al., 2009;Selmani et al., 2008; Sarkhosh et al., 2003; Nasef et al., 2006).Супрессивное действие МСК не распространяется на Т-регуляторныеклетки. Более того, было показано, что МСК, наоборот, стимулируютпролиферацию и повышают выживаемость этой субпопуляции Т-лимфоцитов(Casiraghi et al., 2008; Selmani et al., 2008; Frazier et al., 2014). На данныймомент считается, что иммуномодулирующее действие МСК может бытьчастичноопосредованоусилениемфункциональнойактивностии/илиувеличением численности Т-регуляторных клеток (Burr et al., 2013).

Какизвестно,Т-регуляторныеклеткиобладаютиммуномодулирующимисвойствами. В частности, Т-регуляторные клетки способны подавлятьпролиферациюифункционированиеCD4+иCD8+Т-лимфоцитов,регулировать дифференцировку Т-хелперов, а также дендритных клеток(Bestard et al., 2007; Shevach et al., 2009). Изначально Т-регуляторные клеткичеловека были описаны, как популяция Т-лимфоцитов с фенотипомCD4+CD25+ (Iellem et al., 2001).

Затем в качестве основного гена,регулирующего развитие и функционирование Т-регуляторных клеток, былидентифицирован FOXP3 (Fontenot, et al., 2003). Кроме того, признаком Трегуляторных клеток наравне с экспрессией FOXP3 является низкий уровень25экспрессии CD127 (альфа-цепь рецептора IL-7) в клетках с фенотипомCD4+CD25+,посколькуFOXP3взаимодействуетспромоторомгена,кодирующего CD127, блокируя, таким образом, его экспрессию (Liu et al.,2006). Было показано, что аллогенные МСК могут индуцировать приобретениеТ-лимфоцитами (CD4+) фенотипа Т-регуляторных клеток (Tobin et al., 2013).Полученные в результате такого сокультивирования Т-регуляторные клеткипроявляют супрессорное действие и после удаления МСК (Gonzalez-Rey et al.,2010).

Формирование популяции Т-регуляторных клеток может обеспечитьпролонгированныйэффектиммунопатологическимисистемноговведенияМСКпроцессами, поскольку, времяпациентамциркуляциисТ-регуляторных клеток в кровяном русле значительно больше, чем МСК.Хотя большинство исследований, посвященных анализу влияния МСК наТ-лимфоциты, проводили с использованием МСК, выделенных из костногомозга, в последние несколько лет значительно увеличилось количество работ, вкоторых анализируются МСК из других источников (Strioga et al., 2012).