Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 2
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения". PDF-файл из архива "Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 2 страницы из PDF
Это позволило сделатьвывод о более высокой пролиферативной активности МСК пупочного канатикапо сравнению с МСК костного мозга, а также выявить различия в экспрессииCD10, CD13, CD90 и CD105 на поверхности МСК в зависимости от ихтканевого происхождения.Анализ функциональной активности МСК из разных источников вэкспериментальных системах с использованием в качестве тест-объектов Т- иВ-лимфоцитов, либо В-лимфоидных клеточных линий показал меньшуювыраженность иммунмодулирующего действия МСК костного мозга, посравнению с МСК жировой ткани и пупочного канатика. В модельныхэкспериментах in vitro было продемонстрировано супрессорное влияние МСКразличного тканевого происхождения на аллерген-специфические реакциилимфоидных клеток. Кроме того, было показано, что МСК оказываютразнонаправленноедействиенапродукциюIL-4взависимостиотстимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам, исоответственно, типа иммунного ответа.Впервые проведено сопоставление изменения функционального состоянияМСК под воздействием лимфоцитарных митогенов и стимулированных этимимитогенами лимфоидных клеток.
Были описаны эффекты прямого действия наМСК Т-лимфоцитарного митогена ФГА.8Теоретическая и практическая значимость работыИспользование разных условий сокультивирования позволило определитьпараметры экспериментальных систем, которые являются значимыми длявыявления различий в свойствах МСК, обусловленных индивидуальнымиособенностями доноров. Полученные данные могут быть использованы вкачестве основы для создания алгоритмов контроля качества МСК конкретныхпациентов/доноров, включающих в себя оценку функциональной активностиэтих клеток.Результаты работы свидетельствуют о том, что МСК пупочного канатикамогут являться перспективным источником для клинического применения.Показано, что в этой нише МСК содержатся в большом количестве,сопоставимом с получаемым при выделении МСК из 50-70 мл костного мозга,либоиз3-5млжировойткани.Количествожизнеспособныхипролиферирующих МСК, которые можно получить из образца пупочногоканатика, зависит от величины временного промежутка между родами иначаломобработкиматериала.ПолучениеМСКиз периваскулярногопространства проводили с помощью оптимизированной в ходе работыметодики.Была создана и охарактеризована коллекция первичных культур МСКпупочного канатика, насчитывающая 60 образцов, которые могут бытьиспользованы в клинической практике.Положения, выносимые на защиту1.
МСК, выделенные из пупочного канатика и жировой ткани, как основадля клеточной терапии, обладают рядом преимуществ по сравнению с МСКкостного мозга.2. Общим свойством всех МСК является их способность влиять нафункциональнуюактивностьиммуномодулирующеголимфоидныхдействияМСКклеток,зависятнопроявленияотпараметровэкспериментальных систем.93.
МСК из костного мозга, пупочного канатика и жировой ткани способныингибировать проявления ряда аллерген-специфических эффекторных реакцииin vitro.4. Взаимодействие МСК и клеток иммунной системы в присутствиилимфоцитарных митогенов сопровождается активацией в МСК сигнальныхпутей, опосредованных транскрипционным фактором NFkBАпробация работыОсновные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены наVРоссийскойнаучно-практическойконференции«Аллергическиеииммунопатологические заболевания – проблема 21» (Санкт-Петербург, 2014),Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапияиклеточныетехнологии»(Санкт-Петербург,2013),Объединенномиммунологическом форуме (Н.Новгород, 2013).По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьив журналах из перечня ВАК РФ.Личный вклад автораОсновная часть экспериментальной работы, планирование экспериментов,описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатоввыполнены автором самостоятельно.
Измерения концентрации цитокиновметодом ИФА осуществлялись соместно с Супильниковой О.В., что нашлоотражение в соместных публикациях.Структура и объем диссертацииДиссертация изложена на 158 страницах машинописного текста ивключает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов,изложение полученных результатов и их обсуждение, выводы и списоклитературы. Текст диссертации, сопровождается 54 рисунками и 6 таблицами.Список литературы содержит 297 источника, из них 281 на иностранном языке.10Глава 1. Обзор литературы1.1. Выделение и культивирование МСКВпервыемезенхимныестволовыеклеткибылиполученыА.Я.Фриденштейном с коллегами в 1968 году в лаборатории иммуноморфологии вНИИ эпидемиологии и микробиологии им.
Н.Ф. Гамалеи РАМН из костногомозгаморскойсвинки.Описанныеклеткихарактеризовалисьфибробластоподобной морфологией и способностью образовывать колонии(Фриденштейн и др., 1968). Из тканей человека МСК были выделены в группеCaplan A.I (Syftestad et al., 1985). Сам термин «мезенхимные стволовые клетки»(mesenchymal stem cells) также впервые появился в работе Caplan с соавторамив 1991 году (Caplan et al., 1991). Затем в работе Pittenger c соавторами (1999)была описана способность МСК костного мозга дифференцироваться востеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях, а также их высокаяпролиферативная активность.
Для МСК была показана способность ксамоподдержанию популяции и дифференцировке, т.е. наличие признаковстволовых клеток.В последующие годы МСК были получены из жировой ткани (Zuk et al.,2002), плаценты (Fukuchi et al., 2004), пуповинной крови (Erices et al., 2000),пульпы зуба (Nagatomo et al., 2006), эндометрия (Земелько и др., 2011),периферической крови (Zvaifler et al., 2000), а также из пупочного канатика(Wang et al., 2004; Covas et al., 2003).МСК, полученные из неонатальных тканей – плаценты и пупочногоканатика, привлекают все больше внимания исследователей.
Прежде всего, этосвязано с возможностью получения биологического материала без инвазивныхпроцедур и сопряженных с ними побочных эффектов. Впервые детальноеописание клеток, полученных из пупочного канатика и их классификация какМСК (на основе соответствия фенотипа описываемых клеток фенотипу МСК, атакжеспособностидифференцироватьсявадипоциты,хондроцитыиостеобласты) было проведено в работе Wang с соавторами (Wang et al., 2004). Вдальнейшем была показана возможность получения МСК не только из11Вартонова студня (Wang et al., 2004), но и из периваскулярного пространствапупочной вены (Ennis et al., 2008), а также из амниотической мембраны (Mihuet al., 2009) (Рис.1.).
Накоплены данные, свидетельствующие о том, что МСК,выделенные из разных регионов пупочного канатика, являются отдельнымипопуляциямиспролиферативной(Conconi,2011).пролиферативнуюодинаковымактивностьюМСКиммунофенотипом,идифференцировочнойВартоноваактивностьинонестудняимеютэкспресcируютразличнойспособностьюболеенизкуюпанцитокератиниповерхностный антиген CD146, а МСК первиваскулярного пространствахарактеризуются высокой скоростью роста популяции in vitro и высокимуровнем экспрессии панцитокератина и CD146 (Carvalho et al., 2011). Крометого, МСК из этих двух регионов отличаются по уровню продукции IL-6 и Flt3(Xu et al., 2014).Рисунок 1.1.
Схема строения пупочного канатика человека.Поэтомудляпоследующейкорректнойинтерпретациирезультатовнеобходимо учитывать методику выделения МСК. На данный моментсуществует более 10 описанных способов получения МСК из тканей пупочногоканатика с различной степенью эффективности выделения (Baudin et al., 2007;Kim et al., 2013; Fong et al., 2010), которые заключаются в энзиматическойобработке тех или иных участков пупочного канатика, либо его фрагментовцеликом.12Одной из основных характеристик источника получения МСК является ихсодержание в исследуемой ткани. Известно, что МСК составляют порядка0.001- 0.01% от общего количества мононуклеарных клеток, которые могутбыть получены в ходе центрифугирования аспирата костного мозга наградиенте фиколла (Pittenger et al.,1999.). Из 1 г жировой ткани возможнополучение 5 × 103 МСК (Fraser et al., 2006).
В тоже время, данные о содержанииМСК в периваскулярном пространстве пупочной вены на данный моментотсутствуют.Возможность получения терапевтически эффективной дозы МСК для ихклинического применения напрямую зависит от пролиферативной активностии скорости старения клеток в условиях in vitro.
Согласно литературнымданным, пролиферативный потенциал МСК значительно различается междуклетками, полученными из разных источников. Большинство авторов сходитсяво мнении, что МСК, выделенные из материала более молодых доноров,пролиферируют быстрее и способны пройти в культуре большее числопассажей (Siegel et al., 2013; Li et al., 2014). Поэтому МСК из неонатальныхтканей (плацента, пупочный канатик, пуповинная кровь) могут обладатьмаксимальной пролиферативной активностью, что и было продемонстрированоin vitro (Baksh et al., 2007).
МСК костного мозга имеют максимальное времяудвоения и способны пройти наименьшее количество пассажей по сравнению сМСК, полученными из пупочного канатика и жировой ткани (Baksh et al.,2007).Как известно, функционирование стволовых клеток, в том числе МСК,зависит от факторов их микроокружения, которые объединяют в понятие«ниша стволовых клеток». Данное понятие было предложено в 1978 г. R.Schofield (Schofield, 1978) и включает в себя совокупность факторовмикроокружениястволовыхклеток(газовыйсостав,межклеточныевзаимодействия, состав межклеточного вещества, цитокиновый фон и др.),влияющиенапролиферацию,дифференцировку,выживаемостьифункционирование стволовых клеток.
Концентрация кислорода является одной13из важных характеристик ниши стволовых клеток. В классической для МСКнише – костном мозге – концентрация кислорода не превышает 6%, такимобразом, in vivo МСК существуют в условиях гипоксии (Eliasson, Jonsson,2010; Yin et al., 2006). В других тканях, из которых были получены МСК,концентрация кислорода также ниже, чем в атмосфере (Pasarica et al., 2009;Simon, Keith et al., 2008).Следовательно, культивирование в условияхгипоксии (пониженное содержание кислорода по сравнению с атмосферным, впределах от 2 до 10%) является более физиологичным для МСК, чемкультивирование в условиях нормоксии (содержание кислорода находится врайоне20%исоответствуетсодержаниюкислородаватмосфере).Доказательством такому представлению могут служить данные ряда авторов,свидетельствующие о том, что повышенное содержание кислорода посравнению с физиологическими условиями (нормоксия) при культивированииМСК in vitro приводит к увеличению времени удвоения, ускорению старенияклеток в культуре, замедлению пролиферации, а также повреждению ДНК(Grayson et al., 2007; Fehrer et al., 2007; Буравкова и др., 2009; Basciano et al.,2011).