Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения)
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения". PDF-файл из архива "Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
Санкт-Петербургский Государственный УниверситетКафедра цитологии и гистологииНа правах рукописиАЙЗЕНШТАДТ АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНАЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙАКТИВНОСТИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГОТКАНЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д.б.н., Самойлович М. П.Санкт-Петербург2015СодержаниеСписок сокращений…………………………………………………………..... 4Введение………………………………………………………………………… 5Глава 1.
Обзор литературы…………………………………………................. 111.1 Выделение и культивирование МСК ……………………………….. 111.2. Иммунофенотипическая характеристика МСК …………………..... 151.3. Проявления функциональной активности МСК по отношению кТ-лимфоцитам…………………………………………………………….. 211.4. Проявления функциональной активности МСК по отношению кВ-лимфоцитам………………………………….......................................... 271.5.
Проявления функциональной активности МСК при аллергенспецифических реакциях лейкоцитов…………………………………… 301.6. Изменение функционального состояния МСК при ихвзаимодействии с компонентами иммунной системы………..…............ 32Глава 2. Материалы и методы…………………………………………………. 372.1. Получение и культивирование МСК………………………………... 372.2. Культивирование В-клеточных линий ……………………………... 382.3. Дифференцировка МСК……………………………………………...
392.4. Морфологическая характеристика МСК…………………………… 392.5. Определение пролиферативной активности МСК ………………… 402.6. Иммунофенотипирование культур МСК………………………….. 402.7. Получение и активация клеток мононуклеарной фракции крови… 402.8. Выделение популяции В-лимфоцитов .......................……………..... 412.9. Сокультивирование МСК и клеток мононуклеарнойфракции периферической крови……………………………………….... 412.10. Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266..... 422.11.
Оценка пролиферации лимфоцитов………………………………. 422.12. Иммунофенотипирование лимфоцитов…………………………… 432.13. Иммуноферментный анализ……………………………………….. 442.14. Оценка уровня продукции иммуноглобулинов …...……………… 4422.15. Иммунофлуоресцентная микроскопия……………...…………….. 452.16. Статистическая обработка результатов…………………………… 46Глава 3. Результаты………………………………………………..……........... 473.1. Особенности получения МСК из пупочного канатика……................. 473.2. Сравнение свойств МСК, культивируемых в нормоксии или вгипоксии………………................................................................................... 493.3. Ростовые характеристики и дифференцировка МСК…….................... 553.4. Иммунофенотип МСК…………………………………………………..
583.5. Проявления функциональной активности МСК присокультивировании с лимфоидными клетками……………………………. 653.5.1. Изучение влияния МСК на Т-лимфоциты………………………...... 653.5.1.1. Влияние МСК на активацию Т-лимфоцитов………………. 663.5.1.2. Влияние МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов………….. 683.5.2. Изучение влияния МСК на В-лимфоциты………..…........................ 693.5.2.1. Влияние МСК на пролиферацию В-лимфоцитов………….. 693.5.2.2. Тестирование функциональной активности МСК налимфобластоидных и миеломных клетках………………………….. 733.5.3. Влияние МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитовпри атопической гиперчувствительности…………………………………. 753.6. Влияние клеток мононуклеарной фракции и лимфоцитарныхмитогенов на функциональное состояние МСК ……………. …………... 823.6.1.
Экспрессия Toll-подобных рецепторов на мембране МСК……... 823.6.2. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК придействии лимфоцитарных митогенов или при сокультивировании слимфоидными клетками …………………………..…………………….. 84Глава 4. Обсуждение……………...……………………………………………. 99Выводы…….………………………………………………………..…………... 127Благодарности………………………………………………………………….. 128Список литературы…………………………………………………….............. 1293Список сокращений.ЛПС – липополисахаридМСК – мезенхимные стволовые клеткиТх1 - T-хелперы 1 типаТх2 - T-хелперы 2 типаФГА – фитогемагглютининФСР – фосфатно-солевой буферВcR – В-клеточный рецепторНLA-I - лейкоцитарный антиген человека I классаIL-4 – интерлейкин 4IL-6 – интерлейкин 6IL-10 – интерлейкин 10INFγ – интерферон гаммаМАРК – митоген-активируемые киназыNF-κB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cellsTcR – Т-клеточный рецепторTGFβ - Трансформирующий ростовой фактор бетаTLR – Toll-подобный рецепторTNFα – фактор некроза опухоли альфа4ВведениеМезенхимныестромальныенедифференцированныезародышевого(стволовые)клетки,листка,клеткипроисходящиеобладающиеспособностью(МСК)–этоизмезодермальногоксамоподдержаниюпопуляции и дифференцировке в клетки мезенхимного ряда (Deans et al., 2000;Rossant, 2001).Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробластоподобнойморфологией,культуральногопластикадифференцироватьсявспособныеиприкреплятьсяформироватьадипогенном,колонииinхондрогенномкповерхностиаvitro,итакжеостеогенномнаправлениях (Фриденштейн и др., 1968; Pittenger et al., 1999).
В более позднихработахтакжебылапродемонстрированаспособностьМСКдифференцироваться в клетки эндотелия (Oswald et al., 2004), кардиомиоциты(Tokcaer-Keskin et al., 2009), нейроны и астроциты (Jori et al, 2005).В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции ислужат для восполнения утраченных элементов кровеносных сосудов иопорно-двигательногоаппарата,длязаживленияран,дляпостроениясосудистой сети плода и плаценты (Bielby et al., 2007; Glenn et al., 2014;Паюшина,2015).ОсуществлениеперечисленныхфункцийМСКобеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектр адгезионныхмолекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов.
Таким образом, МСКгенетически детерминированы к процессам миграции, взаимодействия сдругимиклеточнымиэлементамиимежклеточнымматриксом.Приперемещении по сосудистому руслу и в интерстициальных пространствах МСКконтактируют как с подвижными клетками (например, лейкоцитами), так и срезидентными элементами (эндотелиоцитами, фибробластами, межклеточнымматриксом). Взаимодействия с ними требуют, реализацииразличныхпрограмм миграции, пролиферации и дифференцировки.5С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК invitro, связано их интенсивное изучение и применение в качестве основы дляклеточнойтерапииразличныхзаболеваний.Вмеждународнойбазеклинических испытаний на данный момент зафиксировано более 450исследований с использованием МСК (https://clinicaltrials.gov).
Результатымета-анализа проводимых клинических исследований свидетельствуют оботсутствии серьезных побочных эффектов при введении МСК (Lalu et al.,2012). Несмотря на наличие многообещающих результатов доклинических иограниченных клинических исследований, анализ действия МСК по сравнениюс плацебо для большой выборки пациентов (III/IV фазы клиническихиспытаний) не дал однозначных результатов об эффективности их применения,в частности, для лечения реакции трансплантат против хозяина (РТПХ)(Galipeau,2013).Недостаточновысокаяэффективностьклиническогоприменения МСК во многом обусловлена нехваткой знаний о свойствах МСК,а также неразработанностью методов предварительного тестирования клеток всоответствии с целями их использования.На сегодняшний день дискуссионными остаются вопросы о значимостиразличий в свойствах МСК, обусловленных характеристиками ткани, изкоторой были выделены клетки, а также индивидуальными особенностямидонора биологического материала (Siegel et al., 2013; Rebelatto et al., 2008;Payne et al., 2013; Крылова и др., 2014).
В течение более чем 30 лет послеоткрытия основным источником материала для исследований МСК оставалсякостный мозг человека и лабораторных животных, но, начиная с конца 90-хгодов 20 века, клетки с характеристиками, соответствующими МСК, былинайдены в большинстве органов млекопитающих.
Последнее время все большевнимания исследователей привлекают МСК, выделенные из жировой ткани(Zuk et al., 2002), из плаценты (Fukuchi et al., 2004) и ткани пупочного канатика(Wang et al., 2004; Covas et al., 2003).Логически МСК, находящиеся в столь разных с физиологической точкизрения нишах, должны были бы различаться набором важных биологических6характеристик. Тем не менее, при изучении МСК, выделенных из разныхтканей, отмечали несомненное сходство между ними по экспрессиимембранных антигенов, по пролиферативному и дифференцировочномупотенциалу (Musina et al., 2005; Vishnubalaji et al., 2012; Covas et al., 2008).Вместе с тем функциональные особенности МСК различного тканевогопроисхождения остаются малоизученными.Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одногоисследования, с помощью стандартизованных методических приемов сравнитьфункциональные характеристики МСК, выделенных из костного мозга,жировой ткани и пупочного канатика человека.В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующиезадачи:1.
Получить первичные культуры МСК из костного мозга, жировой ткани ипериваскулярного пространства пупочного канатика человека и сравнить ихростовые характеристики.2. Сопоставить иммунофенотипичесикие характеристики МСК, выделенныхиз указанных источников.3. Изучить функциональную активность МСК из разных источников всистемах контактного сокультивирования с Т-лимфоцитами.4. Исследовать проявления функциональной активности МСК по отношениюк В-лимфоидным клеткам.5. Изучить влияние МСК из разных источников на аллерген-специфическиеэффекторные реакции в модельной системе in vitro.6.ОценитьвзаимодействииизменениесфункциональногоиммунокомпетентнымисостоянияклеткамииМСКподприихвлияниемлимфоцитарных митогенов.7Научная новизнаОсновнойособенностьюпроведенногоисследованияявляетсясопоставление морфо-функциональных свойств МСК различного тканевогопроисхождениясиспользованиемнабораметодическихприемоввстандартизованных экспериментальных условиях.Оценкуморфологических,иммунофенотипическихиростовыххарактеристик проводили на большой выборке клеточных культур МСКкостного мозга, жировой ткани и пупочного канатика.