Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 6

На данный моментидентифицировано 11 TLR человека. В ряде работ было показано, что МСКконститутивно экспрессируют мРНК TLR с 1 по 9 (Optiz et al., 2009; RomieuMourez et al., 2009).Недавно была предложена концепция, описывающая существования двухсубтипов МСК, названных по аналогии с классификацией макрофагов:провоспалительные МСК1 и иммуносупрессорные МСК2, поляризация междукоторыми происходит в ответ на взаимодействие специфических лигандов сTLR (Waterman et al., 2010; Romieu-Mourez et al., 2009). В своей работеWaterman с соавторами (2010) показали, что стимуляция TLR3 приводит к32повышению продукции IL-4, CCL10, CCL5, а TLR4 – к продукциипровоспалительных факторов: IL-6 и IL-8.

В качестве агонистов для TLR4использовали LPS и INFγ, а для TLR3 – poly(I:C), с которыми МСКинкубировали не более часа за 1-2 суток до анализа. Субтипы МСК, описанныевыше, возникали только при индукции соответствующими агонистами Tollподобных рецепторов, и их не наблюдали одновременно в одной культуре.КонститутивнаяэкспрессияTLR3вМСКпоказанавнесколькихисследованиях. В клетках обнаруживаются мРНК TLR3 (Raicevic et al., 2012;Chen et al., 2013), а также методами проточной цитофлуорометрии доказаноприсутствие в клетках экспрессированного белка (Chen et al., 2013).Активация TLR3 в результате взаимодействия с двухцепочечной РНК(dsRNA)приводиткактивациисигнальныхпутей,опосредованныхадаптерным белком TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-b) иодним из транскрипционных факторов – IRF3 или NF-κB (Gauzzi et al., 2010),что схематично представлено на Рис.1.4.Рисунок 1.4.

Схема сигнальных каскадов, связанных с TLR3 (Цит. по Gauzziet al., 2010).33В то же время результаты разных групп исследователей расходятся в оценкеэкспрессии TLR4 в МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика.При анализе мРНК МСК, полученных из разных источников, был показандостаточно высокий уровень экспрессии TLR4 (Opitz et al., 2009; Chen et al.,2013). Методом проточной цитофлуорометрии продемонстрировано, что TLR4присутствует только на поверхности МСК, полученных из костного мозга ижировой ткани (Raicevic et al., 2011). Напротив, в работе Chen c соавторами(2013) наблюдали достаточно высокий уровень экспрессии TLR4 в МСКпупочного канатика. Данные Romieu-Mourez с соавторами свидетельствуют оботсутствии экспрессии TLR4 на поверхности МСК костного мозга (RomieuMourez et al., 2013).Таким образом, вопрос об уровне экспрессии, по крайней мере, TLR4 наповерхности МСК различного тканевого происхождения является спорным.Уровень экспрессии TLR3 и TLR4, а также их изменение в зависимости отфакторов микроокружения является признаком способности МСК распознаватьширокий спектр лигандов, присутствующих в местах воспаления илиповреждения тканей.Передачасигнала отTLR4осуществляется поMyD88-зависимомусигнальному пути, который включает в себя рекрутирование MyD88, чтоприводит к активации каскада MAPK и транслокации транскрипционногофактора NF-κB (Meylan et al., 2006), либо по MyD88-независимому пути черезTRIF, который также приводит к активации МАР-киназ и транскрипционныхфакторов NF-κB и IRF (interferon-responsive factors) (O’Neill, Bowie, 2007).

Всигналинге от TLR4, в отличие от TLR3, участвует TRAM (Trif-related adaptormolecule) (Takeda, Akira, 2005) (Рис.1.5.).34Рисунок 1.5. Схема сигнальных каскадов, связанных с TLR4 (Цит. по Zeuneret al., 2015).Таким образом, при активации TLR3 и TLR4 запускается ряд сигнальныхкаскадов, приводящих к связыванию с ДНК транскрипционного фактора NFκB, в также АР-1, IRF3, регулирующих транскрипцию различных биологическиактивных факторов (Akira S., Takeda K., 2004).NF-κB–регулирующийтранскрипционныйнагенетическомпротивовоспалительныхфакторуровнеплейотропногоработу,какпро-действия,такифакторов (Ghosh, Karin, 2002, Greten et al., 2007;www.NF-κB.org).

NF-κB был впервые выделен из В-лимфоцитов мыши иописан как регулятор гена легкой κ-цепи (nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells) (Sen, Baltimore, 1986). Транскрипционный факторNF-κB–этосемейство(RelA) , RelB и c-Rel,цитоплазматическихсуществующихвбелков,видер50 , р52 , р65гомодимеровигетеродимеров (O’Dea, Hoffmann, 2010).

Наиболее распространенной формойNF-κB является гетеродимер субъединицы р65 с субъединицей р50 или р52(Vallabhapurapu, Karin, 2009; Chen et al., 1998). Димеры в не активированномсостоянии существуют в цитоплазме в комплексе с белком IκB (inhibitory35subunit from NF-κB), который маскирует сигнал ядерной локализации,препятствуя, таким образом, импорту в ядро (Hayden, Ghosh, 2008). Всемейство IκB входит несколько белков (IκBα, IκBβ, IκBγ/p105, IκBδ/p100,IκBε), имеющих анкириновые повторы для связывания с Rel доменом NF-κB.Активация NF-κB заключается в фосфорилировании (по остаткам серина вположении 32 и 36 в N-концевой части молекулы), убиквитинизации ипоследующей деградации IκB в протеосоме (Scherer et al., 1995), в результатечего, димер высвобождается и транслоцируется в ядро, где происходитсвязывание со специфическими последовательностями.

Фосфорилирование IκBосуществляется IκB киназным комплексом (IKK), состоящим из субъединицIKKα и IKKβ c каталитической активностью и регуляторной субъединицыIKKγ/ NEMO (NF-κB essential modulator) (Karin et al., 2000). В свою очередь,фосфорилированиеIKKможетосуществлятьсяразличнымикиназамисемейства MAPKKК (Mitogen-activated protein kinases kinases kinases) присвязывании соответствующих лигандов с TLR (Рис. 1.4.

и 1.5.), с членамисуперсемейства рецептора TNFα (TNFR superfamily) (Basak, Hoffmann, 2009),Т- и В-клеточными рецепторами (TCR и BCR), комплексом CD40/RANK.Таким образом, транслокация NF-κB является одним из ключевых моментовфункционированиясигнальныхпутей,опосредованныхэтимтранскрипционным фактором, необходимым для связи внеклеточных стимулови активации транскрипции специфических генов-мишеней. Работа сигнальнойсистемы, связанной с NF-κB, регулируется, в том числе кинетическиммеханизмом, т.е. от времени и продолжительности активации NF-κB зависит исигнальный путь, который активирован и, соответственно, результирующийответ (Covert et al., 2005). Например, TNFα –индуцированный сигналингослабевает в течение 8 часов, а ЛПС вызывает более длительную активациюNF-κB (O’Dea, Hoffmann, 2010).

Поэтому время транслокации NF-κB в ядроможетявлятьсяважнойхарактеристикойизмененияфункциональногосостояния клеток в ответ на тот или иной стимул.36Глава 2. Материалы и методы2.1. Получение и культивирование МСКМСК выделяли из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика.Необходимым условием получения биологического материала было наличиеинформированного согласия доноров.Костный мозг получали в ходе пункции подвздошной кости у здоровыхдоноров (25 человек), проводимой по стандартной методике.

Аспират костногомозга разделяли центрифугированием (400 g, 30 мин) на градиенте фиколла сплотностью 1,077 г/мл (Биолот, Россия). Фракцию мононуклерных клетоксобирали на границе фаз, промывали раствором фосфатно-солевого буфера(ФСР), после чего вносили в полную питательную среду (AdvancedMesenchymal Stem Cells Media, HyClone, Новая Зеландия) c добавлением 20%заменителя сыворотки (Hyclone, Новая Зеландия) и высевали во флаконы(площадь 75 см2, плотность 100 тыс. кл/см2).

Через 3 дня проводили сменусреды для удаления неприкрепившихся клеток.Образцы подкожной жировой ткани объемом 2-4 мл были получены от 13здоровых доноров в ходе липоэктоми с наружной поверхности бедра постандартной методике. Ткань извлекали из контейнера с транспортной средой,механически измельчали, затем инкубировали при 37оС в 0,2 % раствореколлагеназы (тип I, Sigma-Aldrich, США) в ФСР.

Диссоциированные клеткиотмывали от фермента центрифугированием (400 G, 10 мин) и высевали вофлаконы при плотности 100–400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили такжечерез 72 ч.Пупочные канатики получали при неосложненных родах. Транспортировкуиз родильных домов г. Санкт-Петербурга осуществляли в стерильномконтейнере с 1% раствором смеси пенициллина, стрептомицина и фунгизона вфизиологическом растворе. Для выделения клеток промывали пупочную венупоследовательно 0,02% Версеном и 0,2% раствором коллагеназ I и IV типа(Sigma-Aldrich, США) в ФСР. После этого один конец пупочного канатикаклеммировали и заполняли пупочную вену раствором коллагеназы, затем37клеммировали со второй стороны и инкубировали в течение 20 мин при 37оС(первая ферментация).

Затем пупочную вену промывали 2-3 раза ФСР.Полученную взвесь клеток в ФСР центрифугировали (400 G, 10 мин),ресуспендировали в полной питательной среде и высевали во флаконы приплотности 100–400 тыс кл/см2. При этом большинство эксплантированныхклетоксоставляликлеткиэндотелияпупочнойвены.Послепервойферментации пупочную вену снова заполняли раствором коллагеназ, какописано выше, и инкубировали в течение 40 мин при 37 0С (втораяферментация).

После второй ферментации повторяли те же процедуры, что ипосле первой ферментации. В полученной в результате этого суспензиипрактическине содержалоськлетокэндотелиясосудов.Всегобылопроанализировано 78 культур МСК, полученных из пупочного канатика.При достижении 70-80 % конфлюентности монослоя МСК, вне зависимостиот источника их получения, пересевали при плотности 1000 кл/см2 икультивировали в полной питательной среде с 10 % заменителя сыворотки. Вэкспериментах использовали культуры на 2-3 пассаже, достигшие 60-70%конфлюентности, если не указано иное.МСК культивировали при 37оС в атмосфере 5% СО2 и 20% (условиянормоксии) или 5% (условия гипоксии) О2 с использованием мультигазовыхинкубаторов (BBD 6220, Thermo Scientific, США) с возможностью подачиазота.2.2.