Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 9

Результатыпредставлены для культур, находящихся на 3 пассаже. По оси ординат –относительное содержание клеток.Таблица 3.1. Средний размер МСК (мкм) костного мозга, жировой ткани ипупочного канатика, после культивирования в условиях гипоксии и нормоксииИсточникМСККостный мозгнормоксияЖировая тканьгипоксия нормоксияПупочный канатикгипоксия нормоксиягипоксияСредний18,5 ± 1,1* 18,2 ± 0,9# 15,1 ± 1,3*# 17,8 ± 0,8# 16,1 ± 1,25*#размер МСК 22,2 ± 1,4в суспензии*- достоверные отличия по сравнению с показателями для нормоксии, # - достоверныеотличия по сравнению с МСК костного мозга.52При сравнении доли живых МСК в культуре при культивировании вусловиях нормоксии и гипоксии также не было выявлено достоверно значимыхотличий (Таблица 3.2.).Таблица 3.2. Жизнеспособность МСК 2-го пассажа при культивировании вусловиях гипоксии и нормоксии.

Представлено среднее количество живыхклеток (7AAD-) ± стандартное отклонениеИсточникМСКДоля 7AADнегативныхклеток вкультуреКостный мозгЖировая тканьгипоксия нормоксия гипоксия91,2 ± 7,3 81,8 ± 10,390,3 ± 6,9нормоксия88,5 ± 9,9Пупочный канатикгипоксия нормоксия89,2 ± 7,683,4 ± 5,9Для всех проанализированных культур МСК не было выявлено достовернозначимыхразличийэкспрессирующихмеждуCD90,иммунофенотипомCD105, CD44,МСКСD10, CD13,(доляклеток,CD73+, инеэкспрессирующих CD45, CD34, CD117, CD14) при культивировании вусловиях нормоксии и в условиях гипоксии (см. Главу 3.2.).Пролиферативная активность МСК повышалась при культивировании вусловиях гипоксии по сравнению со стандартными условиями, что выражалосьв уменьшении времени удвоения популяции (Рис.3.7).

Низкая концентрациякислородаприкультивированиитакжеспособствовалаувеличениюдлительности поддержания пролиферативной активности in vitro, то есть,возрастало количества пассажей, в течение которых МСК пролиферирровали.Такая закономерность была показана для всех проанализированных культурМСК вне зависимости от источника их получения.Таким образом, пониженное содержание кислорода (5%) в газовой средеприкультивированииоказывалостимулирующеедействиенапролиферативную активность МСК из всех источников при сохранении ихморфологических характеристик.

Дальнейшее изучение функциональнойактивности МСК проводили при культивировании в условиях гипоксии.53250время удвоения, чА200150100500234567пассаж культивирования250Бвремя удвоения, ч20015010050023456789пассаж культивирования250Ввремя удвоения, ч2001501005002345678910пассаж культивированияРисунок 3.7. Среднее время удвоения популяции МСК, полученных изкостного мозга (А), жировой ткани (Б) и пупочного канатика (В), при ихкультивировании в условиях гипоксии (светло-серые столбцы) и нормоксии(темно-серые столбцы). Указано стандартное отклонение.543.3 Ростовые характеристики и дифференцировка МСКДля сравнительной характеристики пролиферативной активности МСК,полученных из разных источников, проанализировали 12 культур МСКкостного мозга, 7 культур жировой ткани и 30 культур пупочного канатика.Возраст доноров костного мозга составлял от 21 года до 80 лет (46,2 ± 15,8),жировой ткани – от 37 до 90 лет (59 ± 20,4).

В качестве критерия для сравненияпролиферативной активности использовали время удвоения численностипопуляций МСК.Наибольшее время удвоения популяции было характерно для культур МСК,полученных из костного мозга. Время удвоения популяции МСК костногомозга было достоверно выше на всех пассажах по сравнению с МСК,полученными из других источников (P < 0,05). Пролиферация 4 из 12 культурМСК костного мозга сохранялась в течение 6 пассажей, остальные культурыпролиферировали 7 пассажей. После этого пролиферация прекращалась,большинство клеток в культуре были крупными (более 250 мкм) и имелиполигональную форму, с неровными краями и множеством отростков. Втечение 7-10 дней после прекращения пролиферации наблюдали массовоеоткрепление клеток от культурального пластика и значительное увеличениедоли погибших клеток.

На данной стадии отмечали гибель культуры и ееутилизировали.Время удвоения популяции МСК, полученных из жировой ткани ипупочного канатика, было схожим при культивировании до 6 пассажа. Придальнейшем культивировании (после 7 пассажа включительно) время удвоенияпопуляции было достоверно выше (P<0,05) для МСК жировой ткани, посравнению с МСК пупочного канатика. Из 7 культур МСК жировой ткани 4прекратили пролиферировать после 7 пассажа, 2 – после 8 пассажа и клеткиодной из культур пролиферировали в течение 9 пассажей.Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохранялась втечениемаксимальногоколичества пассажейпосравнениюсМСК,полученными из костного мозга и жировой ткани.

22 культуры МСК пупочного55канатика пролиферировали до 8 пассажа включительно, 5 культур – до 9 и 3культуры – до 10 пассажа (Рис.3.8)Время удвоения популяции МСКпупочного канатика для проанализированных культур было практическиодинаковым на 3-5 пассажах, но с 6 пассажа существенно различалось междукультурами, полученными от разных доноров (от 52 до 194 часов).костный мозгжировая тканьпупочный канатик200время удвоения, ч1801601401201008060402002345678пассаж культивирования9110Рисунок 3.8. Среднее время удвоения популяций МСК, полученных изкостного мозга, жировой ткани и пупочного канатика.

Указано стандартноеотклонение.Такимобразом,пролиферативнымМСКкостногопотенциаломизмозгавсехобладалиминимальнымпроанализированныхкультур.Пролиферативная активность МСК, полученных из жировой ткани и пупочногоканатикабылакультивированиисходнойнаснижаласьраннихболеепассажах,резкоуаМСКпридальнейшемжировойткани.Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохранялась в течениенаиболее длительного времени. Минимальное (относительно других пассажейдля одной культуры) время удвоения для МСК вне зависимости от источникаих получения наблюдали на 3 пассаже. В связи с этим, в последующихэкспериментах использовали культуры на 2-4 пассажах.МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатикаобладали способностью к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и56хондрогенномнаправлениях.Анализспособностикдифференцировкипроводили на 3 пассаже.При исследовании способности МСК к дифференцировке через 3 сут последобавления в среду адипогенных стимулов в культурах появлялись клетки,содержащие липидные включения.

После 2 недель культивирования такиеклетки присутствовали во всех исследованных образцах (Рис.3.9.). Прикультивировании МСК в среде, содержавшей факторы индукции остеогеннойдифференцировки,после11-хсутокклеткиначиналиформироватьминерализированный матрикс, количество которого постоянно увеличивалось(Рис.3.9.).Культивирование МСК в среде для хондрогенной дифференцировки втечение 7 дней приводило к появлению в популяции клеток, экспрессирующихколлаген 2 типа (Рис.3.10). Через 2 недели более 60% МСК в культурах,полученных из костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика,окрашивались альциановым синим (Рис.3.9.) (Пиневич и др., 2014).Рисунок 3.9.

Вид культур МСК жировой ткани через 2 недели культивированиив стандартной культуральной среде (А) и в среде, содержащей хондрогенные(Б, окрашивание альциановым синим), адипогенные (В, окрашивание жировымкрасным О) и остеогенные стимулы (Г, окрашивание ализариновым краснымС). Световая микроскопия.57Рис.3.10. Экспрессия коллагена II типа, как маркер дифференцировкиклеток в хондрогенном направлении.

Зеленым отмечены антитела к коллагенуII и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa-488, синим –ядра клеток, окрашенные DAPI. Флуоресцентная микроскопия. Масштабныйотрезок – 5 мкм.Спонтанная дифференцировка в среде без добавления дифференцировочныхстимулов не была показана для всех культур МСК (Пиневич и др., 2014).3.4. Иммунофенотип МСКОдной из основных характеристик МСК является их иммунофенотип.

Намибыло проведено сравнение иммунофенотипа 78 первичных культур МСК,полученных из 25 образцов костного мозга (возраст доноров от 21 года до 80лет (44,3 ± 17,9)), 13 образцов жировой ткани (возраст доноров от 37 до 90 лет(51,4 ± 22)) и 32 образцов пупочного канатика здоровых доноров. Анализпроводили на 2 и 3 пассаже, определяя следующие поверхностные антигены:CD90+, CD105+, CD44+, СD10, CD13, CD73+, CD45, CD34-, CD117, CD14. Всекультуры на момент анализа находились в логарифмической фазе роста,конфлюентность культуры была в пределах 50 – 75%.Процентноесодержаниеклеток,положительныхпоэкспрессииповерхностных антигенов CD90, CD105, CD44, CD73, и отрицательных поэкспрессии CD45, CD34, CD117, CD14, в культурах МСК, полученных изразных источников, было схожим и превышало 90%, что указывает наоднородность всех проанализированных культур по экспрессии этих антигенов(Айзенштадт и др., 2014).

Наибольшая вариабельность наблюдалась по58экспрессии CD13 (аминопептидаза N) и CD10 (нейтральная эндопептидаза) вкультурах МСК пупочного канатика на втором пассаже. При дальнейшемкультивировании (начиная с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83 ±10% и 71 ± 12,5 клеток, соответственно (Таблица 3.3.).На рисунке 3.11. приведен пример иммунофенотипа культуры МСКпупочного канатика № 0714000044 на 2 пассаже.Таблица 3.3. Доля клеток, экспрессирующих указанные поверхностныеантигены в культурах МСК (2 пассаж), полученных из разных источников.ИсточникПупочный канатикМСКгипоксия нормоксияАнтигенСD90+99,2 ± 0,5 98 ± 0,8CD 105+99,7 ± 0,2CD 73+99,3 ± 0,7CD 10+Жировая тканьгипоксияКостный мозгнормоксиягипоксиянормоксия99,3 ± 0,499 ± 0,299 ±0,498,6 ± 1,499,2 ± 0,499 ± 0,899,5 ± 0,399,3 ± 0,598,7 ± 1,199,4 ± 0,598,2 ± 0,699,1 ± 0,490 ± 6,294,5 ± 557,8 ± 17,1 52,3 ± 16,581 ± 13,575,8 ± 19,298 ± 0,986,3 ± 7,1CD 13+34,6 ± 14,5 39,7 ± 10,997,3± 2,190,5 ± 5,696,1 ± 1,992,4 ± 6,3CD 44+99 ± 0,999 ± 0,699,8 ± 0,0598,7 ± 0,497.5 ± 2,398,2 ± 0,8HLA-ABC99,5 ± 0,298,8 ± 199,8 ± 0,199,7 ± 0,399,2 ± 0,199,4 ± 0,4CD 45-3 ± 2,41,7 ± 1,22,5 ± 1,21,9 ± 1,31,9 ± 1,62,4 ± 2,2CD14-3,8 ± 3,53 ± 3,12,4 ± 1,62,5 ± 1,91,5 ± 0,81,1 ± 0,1CD117-4,2 ± 3,85,9 ± 4,61,8 ± 0,52,3 ± 1,11,1 ± 0,40,7 ± 0,6CD34-2,1 ± 1,82,8 ± 23,4 ± 2,13,2 ± 2,63,1 ± 2,82,7 ± 1,7Полужирным шрифтом выделены маркеры, по которым выявлены достоверные различиямежду МСК из разных источников59Рисунок 3.11.