Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 11

Сокультивирование нестимулированных клеток с МСК не приводит к изменению экспрессии HLADR на поверхности Т-лимфоцитов. Более того, в смешанной культуре с МСКвоздействие ФГА не вызывает увеличение доли СD3+HLA-DR+ клеток.(Рис.3.19.).66МНКкостный мозгжировая тканьпупочный канатикCD69+ Т-лимфоциты, %45*#40*#35*#302520****151050без стимулаРисунок3.18.СодержаниеФГАТ-лимфоцитов,экспрессирующихCD69,относительно общего количества Т-лимфоцитов. Голубые столбики –показатель в мононуклеарной фракции; светло-серые – при сокультивированиис МСК костного мозга; темно-серые – жировой ткани;исчерченные -пупочного канатика. * - данные, достоверно отличные от контроля(мононуклеарная фракция без стимула), # - данные, достоверно отличные отпоказателей в мононуклеарной фракции без сокультивирования с МСК вприсутствии ФГА, (Р<0,05).МНКкостный мозгжировая тканьпупочный канатикHLA-DR+ Т-лимфоциты, %20*1816141210#8##6420без стимулаФГАРисунок 3.19.

Cодержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR,относительно общего количества Т-лимфоцитов. Обозначения те же, что и наРис. 3.17.Таким образом, МСК оказывали противоположное влияние на содержаниеТ-лимфоцитов, несущих ранний и поздний маркеры активации, стимулируяэкспрессию СD69, но подавляя индуцированную ФГА экспрессию HLA-DR.673.5.1.2. Влияние МСК на пролиферацию Т-лимфоцитовПроявление функциональной активности МСК оценивали по их влиянию напролиферативную активность ФГА–активированных Т-лимфоцитов в составеклеток мононуклеарной фракции.

Пролиферацию Т-лимфоцитов определяли поснижению интенсивности флуоресценции при разведении флуоресцентнойметки CFSE в популяции живых (7AAD-) Т-лимфоцитов (CD45+CD3+) cпомощью проточной цитофлуорометрии.Для всех культур МСК была показана способность подавлять ФГАстимулированнуюпролиферациюТ-лимфоцитов.Антипролиферативноедействие МСК носило дозозависимый характер и было максимальным приравном соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции (Рис.3.20.). Присоотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции 1:1 и 1:10, МСК изразных источников одинаково эффективно подавляли пролиферацию Тлимфоцитов.

При соотношении 1:100, МСК из костного мозга, снижали долюподелившихся Т лимфоцитов на 14± 5,1 %, в то время как МСК из жировойАДоля поделившихся клеток, %ткани и пупочного канатика на 30± 4 % и 27±3,7 % соответственно (Рис.3.20.).10090костный мозгБжировая тканьпупочный канатик807060*5040*3020*10*****0МНКконтроль1:11:101:100Рисунок 3.20. А.

Пример диаграммы распределения стимулированных ФГА ТлимфоцитовпоинтенсивностифлуоресценцииCFSEприихсокультивировании с МСК пупочного канатика в соотношении 1:1 (1) и безсокультивирования (2). Б. Доля поделившихся Т-лимфоцитов присокультивировании ФГА-стимулированных клеток мононуклеарной фракции сМСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика и безсокультивирования (контроль). По оси абсцисс – соотношение МСК и клетокмононуклеарной фракции. *–данные, достоверно отличные от показателей вконтроле.68Таким образом, МСК различного тканевого происхождения не отличалисьпо выраженности антипролиферативного действия на Т-лимфоциты присоотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции равном 1:1 и 1:10.

Приувеличении количества клеток мононуклеарной фракции (соотношение 1:100),МСК, полученные из пупочного канатика и жировой ткани, подавляютпролиферацию Т-лимфоцитов более эффективно, чем МСК костного мозга.3.5.2. Изучение влияния МСК на В-лимфоциты3.5.2.1. Влияние МСК на пролиферацию В-лимфоцитовДля оценки влияния МСК на пролиферацию В-лимфоцитов выполнили двесерии экспериментов – МСК сокультивировали с клетками мононуклеарнойфракции периферической крови (здоровых доноров) либо с выделенными изнихспомощьюиммуномагнитнойсепарацииВ-лимфоцитами.Сокультивирование проводили в течение 72 часов в присутствии ЛПС.Пролиферацию клеток оценивали по снижению интенсивности флуоресценциипри разведении флуоресцентной метки CFSE в популяции живых (7AAD-)В-лимфоцитов (CD45+CD19+) с помощью проточной цитофлуорометрии.ВпервойсериипроводилисокультивированиеМСКсклеткамимононуклеарной фракции в соотношении 1:1, 1:10 и 1:100, при этомсоотношение МСК и В-лимфоцитов в среднем было приближено к 20:1, 2:1 и1:5 соответственно, поскольку на В-лимфоциты приходилось порядка 5% отобщего числа клеток в мононуклеарной фракции (Рис.3.17.).МСК,полученныеблокировалиизразныхЛПС-стимулированнуюисточников,одинаковопролиферациюэффективноВ-лимфоцитовприравном соотношении МСК и лейкоцитов.

При соотношении МСК и клетокмононуклеарной фракции 1:10 доля поделившихся В-лимфоцитов такжеснижалась, но менее выражено (Рис.3.21).69АДоля поделившихся клеток,%Ряд1100костный мозгжировая тканьпупочный канатикБ8060*40*20Интенсивность флуоресценцииCFSE, отн.ед.***0контрольМНК1:11:10Рисунок 3.21.

А. Пример диаграммы распределения стимулированных ЛПСлимфоцитовпоинтенсивностифлуоресценцииCFSEприихсокультивировании с МСК пупочного канатика в соотношении 1:10 (1) и безсокультивирования(2).Б.ДоляподелившихсяВ-лимфоцитовприсокультивировании ЛПС-стимулированных клеток мононуклеарной фракции сМСК костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика, и безсокультивирования (контроль).

По оси абсцисс – соотношение МСК и клетокмононуклеарной фракции. * –данные, достоверно отличные от показателей вконтроле.При соотношении МСК и лейкоцитов равном 1:100 степень подавленияпролиферации В-лимфоцитов различалась для индивидуальных образцов МСК.(Рис.3.22).70контроль******Рисунок 3.22 Доля поделившихся В-лимфоцитов при сокультивированииЛПС-стимулированных клеток мононуклеарной фракции с культурами МСКкостного мозга, жировой ткани или пупочного канатика (+МСК) всоотношении 100 к 1, по сравнению с ЛПС-стимулированными клеткамимононуклеарной фракцией без сокультивирования (контроль). По оси ординат доля поделившихся В-лимфоцитов относительно общего количества Влимфоцитов. * - достоверные отличия от показателя в мононуклеарнойфракции.Во второй серии экспериментов проводили сокультивирование МСК спопуляциейВ-лимфоцитов, выделеннойс помощью иммуномагнитнойсепарации.

Соотношение МСК и В-лимфоцитов составляло 10:1, 1:1 или 1:10при чистоте популяции В-лимфоцитов более 95%. Было показано, что МСКподавляют пролиферацию В-лимфоцитов только при соотношении клеток вкультуре 1:1 (Рис.3.23).При увеличении доли МСК (соотношение МСК и В-лимфоцитов равное10:1) не происходило подавление пролиферации В-лимфоцитов, а в частиэкспериментов количество клеток прошедших серию удвоений возрастало (2культуры МСК жировой ткани, и 1 культура МСК пупочного канатика)(Рис.3.23.Б.).

При соотношении МСК и В-лимфоцитов равном 1:10 МСК такженевызывалисниженияпролиферативнойактивностиВ-лимфоцитов.(Рис.3.23.).71Рисунок 3.23. А. Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитовпри их сокультивировании с МСК из костного мозга, жировой ткани ипупочного канатика, по сравнению с ЛПС-стимулированными В-лимфоцитамибез сокультивирования (контроль). Обозначения те же, что на Рис 3.21. Б.ИнтенсивностьфлуоресценциивCFSEВ-лимфоцитахприихсокультивировании с МСК жировой ткани в соотношении 10:1 (2) и безсокультивирования с МСК (1).Во всех поставленных экспериментах МСК не снижали жизнеспособностьклеток мононуклерной фракции и отдельно В-лимфоцитов, что было показанос помощью окраски 7ААD.

(Табл. 3.4.).Таблица 3.4. Жизнеспособность В-лимфоцитов и клеток мононуклеарнойфракции при сокультивировании с МСК из различных источников и в контроле81 ± 10МСК костногомозга79 ± 6,5МСК жировойткани89 ± 8,7МСК пупочногоканатика84 ± 7,377,5 ± 973 ± 8,278 ± 670 ± 11ЖизнеспособныеКонтрольКлетки мононуклеарнойфракции, %В-лимфоциты, %Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокойзависимости характера влияния МСК на В-лимфоциты от условий постановкиэксперимента, в первую очередь от наличия в смешанной культуре другихиммунокомпетентных клеток, а также соотношения МСК и лимфоцитов.Индивидуальная вариабельность влияния культур МСК на пролиферацию ВлимфоцитовпроявляетсятольковсмешаннойкультуреМСКимононуклеарной фракции при их соотношении 1:100.723.5.2.2.ТестированиефункциональнойактивностиМСКналимфобластоидных и миеломных клеткахПринимая во внимание неоднородность полученных результатов прианализе влияния МСК на пролиферацию В-лимфоцитов, для оценкивоздействия МСК на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами вкачестве эффекторных клеток были выбраны В-клеточные линии Namalva иU266.