Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 10

Гистограммы, отражающие иммуннофенотип культурыМСК пупочного канатика 0714000154. Изотипический контроль – пунктирныелинии. По оси абсцисс — интенсивность флюоресценции (отн. ед.), по осиординат — число событий.МСК всех проанализированных культур экспрессировали HLA I. Уровеньэкспрессии оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции,зависящий от плотности изучаемого антигена на поверхности клеток. Уровеньэкспрессии HLA I был одинаковым для культур МСК, полученных из костногомозга, пупочного канатика и жировой ткани (Рис.3.12.).30255050MFI, отн.едХсредн,отн.

ед.Хсредн, отн. ед.606020404015303010202010105000костныйкостныймозгмозгРисунокжироваяжироваятканьткань3.12.пупочныйпупочныйканатикканатикСредняяинтенсивностьфлуоресценцииМСК,экспрессирующих HLA I, полученных из костного мозга, жировой ткани ипупочного канатика. Указано стандартное отклонение.60Проводили сравнение данного показателя между культурами МСКжировой ткани и лимфоцитами периферической крови, полученными от однихи тех же доноров (3 здоровых донора).

Эксперименты были поставлены в двухповторностях для каждого донора с использованием МСК на 2 и 3 пассажах.Было показано, что средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитовпериферической крови, экспрессирующих HLA I, практически не отличается(Рис.3.13.).А30БMFI (HLA I-FITC), отн.ед.2520151050HLA I-FITCМСКлимфоцитыРисунок 3.13. Уровень экспрессии HLA I на МСК и лимфоцитахпериферической крови. А - Гистограмма интенсивности флуоресценции МСКжировой ткани (гистограмма с серым фоном) и лимфоцитов периферическойкрови (черная линия), экспрессирующих HLA I.Пунктирная линия –изотипический контроль.

Б – Средняя интенсивность флуоресценции МСК илимфоцитов периферической крови. Указано стандартное отклонение.Также изменение интенсивности экспрессии HLA I на поверхности МСКанализировалиприсокультивированииМСКсФГА-илиЛПС-активированными аллогенными лимфоцитами, либо при добавлении к культурепровоспалительного цитокина TNFα. Эксперименты проводили на 3 культурахМСК, полученных из костного мозга, 3 - из жировой ткани и 3 - из пупочногоканатика.61При сокультивировании МСК с лейкоцитарной фракцией периферическойкрови здоровых доноров в присутствии ФГА средняя интенсивностьфлуоресценции возрастала в 2 раза (на 114,6 ± 43 %). В смешанной культуре слейкоцитами в присутствии ЛПС уровень экспрессии HLA I увеличивался на61,1 ± 22 %.

При сокультивировании с лейкоцитами в отсутствиистимулирующего агента изменений в уровне экспрессии HLA I на поверхностиМСК не наблюдали. Аналогично, в отсутствии лейкоцитов, стимулирующиеагенты (как ЛПС, так и ФГА) не вызывали смещения интенсивностифлуоресценции.Добавление к культуре МСК только одного провоспалительного цитокинаTNFα также приводило к усилению экспрессии HLA I на поверхности МСК.При этом значения средней интенсивности флуоресценции увеличивались в 3раза (в среднем на 226,7 ± 38 %) (Рисунок 3.14.).Рисунок 3.14.

Изменение средней интенсивности флуоресценции культурМСК, экспрессирующих HLA I (MFI), полученных из костного мозга, жировойткани и пупочного канатика, в присутствии митогенов (ЛПС и ФГА), либоTNFα, либо при сокультивировании с интактными лейкоцитами или митогенактивированными лейкоцитами. По оси ординат отложены изменения MFIотносительно значений в контроле, принятых за 100%.

Указано стандартноеотклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05.62Повышение уровня экспрессии HLA I происходило на клетках всех культурМСК, вне зависимости их тканевого происхождения.Вовсехпроанализированныхкультурахболее99%клетокэкспрессировали антиген СD90, но уровень экспрессии различался в МСК,полученных из разных источников. Средняя интенсивность флуоресценции вкультурах МСК, полученных из костного мозга составляла 48,3 ± 26, жировойткани – 109 ± 48, а пупочного канатика – 123,5 ± 51 (Рис.

3.15.). Максимальныезначения были получены для двух культур МСК пупочного канатика (Хсредн =238 и 254), в то время как минимальные – для культуры МСК костного мозга(Хсредн = 13,4).Рисунок 3.15. А. Средняя интенсивность флуоресценции культур МСК,экспрессирующих антиген CD90, полученных из костного мозга, жировойткани и пупочного канатика. Указаны стандартные отклонения. * –достоверные различия при р<0,05. Б.

Интенсивность флуоресценции клеток,экспрессирующих антиген CD90, в трех культурах МСК, полученных изкостного мозга (зеленый цвет), жировой ткани (желтый цвет) и пупочногоканатика (синий цвет). Пунктирная линия – изотипический контроль.Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходныйиммунофенотип. Исключением является показатель средней интенсивностифлуоресценцииклеток,экспрессирующихCD90.Оценкасреднейинтенсивности флуоресценции показала достоверные отличия в уровне63экспрессии CD90 между МСК костного мозга, по сравнению с МСК пупочногоканатика и жировой ткани. Различий в уровне экспрессии CD90 на поверхностиМСК пупочного канатика и жировой ткани выявлено не было.МСК, выделенные из разных источников, могут отличаться по уровнюэкспрессии CD105. Средняя интенсивность флуоресценции МСК пупочногоканатика, является достаточно постоянной в различных культурах и, в среднем,составляет 14,9±6,8. В тоже время была показана значительная разнородностькультур МСК жировой ткани и костного мозга, полученных от разных доноров(Рис.3.16).

Индивидуальная вариабельность культур МСК костного мозга ижировой ткани, затрудняет определение влияния тканевого происхожденияклеток на экспрессию CD105.Рисунок 3.16. Средняя интенсивность флуоресценции МСК из разныхисточников,экспрессирующихантигенCD105.Указаныстандартныеотклонения.Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходныйиммунофенотип, но существуют различия в экспрессии CD10, CD13, CD105 иCD90.643.5. Проявления функциональной активности МСК при сокультивированиис лимфоидными клеткамиДля оценки функциональной активности МСК из разных источниковиспользовали экспериментальную модель, в которой изучали влияние МСК налимфоидные клетки при их сокультивировании.В качестве тест-объектов (или эффекторных клеток) выступали аллогенныеклетки мононуклеарной фракции периферической крови доноров, полученнойвыделением на ступенчатом градиенте фиколла и имеющей клеточный состав,представленный на Рис.3.18.Рисунок 3.17.

Усредненные данные о клеточном составе мононуклеарнойфракции периферической крови после ее выделения на градиенте фиколла наоснове анализа 24 образцов.Клетки мононуклеарной фракции стимулировали ФГА, либо ЛПС, которыеявляются митогенами для Т- и В-лимфоцитов, соответственно.Для определения характера влияния МСК на функциональную активностьВ-лимфоцитовпроводилисокультивированиеМСКсВ-лимфоиднымиклеточными линиями и с популяцией В-лимфоцитов, полученной с помощьюиммунномагнитной сепарации.Отдельная серия экспериментов была посвящена изучению действия МСКна клетки мононуклеарной фракции в присутствии специфического аллергена.653.5.1. Изучение влияния МСК на Т-лимфоциты3.5.1.1. Влияние МСК на активацию Т-лимфоцитовДля анализа влияния МСК на активацию Т-лимфоцитов оценивалиизменение доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации –СD69 и поздний маркер активации - HLA-DR через 3 и 72 ч после добавлениямитогена (ФГА).

Определение количества активированных Т-лимфоцитовпроводили при сокультивировании с МСК клеток мононуклеарной фракциипериферической крови 5 здоровых доноров.В результате инкубации клеток мононуклеарной фракции с ФГА в течение 3ч происходит увеличение содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующихранний маркер активации CD69. Сокультивирование интактных клетокмононуклеарной фракции с МСК приводило к усилению экспрессии СD69 наповерхности Т-лимфоцитов. Источник получения МСК не сказывался настепени активации лимфоцитов. Внесение ФГА в смешанную культуруаддитивно увеличивало количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD69.При сокультивировании с МСК костного мозга доля СD3+СD69+ среди CD3+клеток составляла 36,4±3 %, с МСК жировой ткани - 32,3±3,1% и 35,4±2,4 %при сокультивировании МСК пупочного канатика (Рис.3.18).Воздействие ФГА в течение 72 часов на клетки мононуклеарной фракцииприводит к увеличению содержания Т лимфоцитов, экспрессирующих поздниймаркер активации HLA-DR, в среднем в 2,5 раза.