Диссертация (Экспериментальный анализ функциональной активности мезенхимных стволовых клеток различного тканевого происхождения), страница 8

Для детекции IgE в клеткахлинии U266 использовали антитела E-5D4, для определения IgM в клеткахлинии Namalva – 2В9 (антитела получены в лаборатории гибридомнойтехнологии ФГБУ РНЦРХТ). Cбор клеток линий Namalva или U266 послесокультивирования с МСК проводили по той же схеме, что и клеткимононуклеарнойфракции.Затемклеткипоследовательноотмывали,фиксировали ледяным ацетоном в течение 10 мин, пермеабилизовали 0,1%ным раствором тритона Х-100 на ФСР (15 мин при комнатной температуре) иокрашивали соответствующими моноклональными антителами в течение 10минут в темноте при комнатной температуре. Измерения проводили спомощью проточного цитофлуориметра FC500 (Beckman Coulter, США) всоответствии с инструкцией производителя.442.15.

Иммунофлуоресцентная микроскопияМСК высевали в концентрации 10 тыс кл/см2 в лунки 6-ти луночногопланшета, на дно которых, помещали покровные стекла. Сокультивирование склетками мононуклеарной фракции проводили, как описано выше, в течение30, 60, 90, 180 мин или 24 ч в присутствии ФГА (10 нг/мл), ЛПС (10 нг/мл) илисоответствующего анамнезу донора периферической крови аллергена.После окончания сокультивирования, удаляли культуральную среду инеприкрепленные клетки и однократно промывали стекла ФСР.

Затем клеткификсировали 3,7% раствором формалина в ФСР (Sigma, США) в течение 10минут, после чего пермеабилизировали мембрану клеток в течение 8 минут0,1% раствором Triton-X100 (Sigma, США). Для определения локализациисубъединицы р65/RelA транскрипционного фактора NF-κB в МСК препаратыпоследовательноинкубировали с первыми кроличьими поликлональнымиантителами против р65 субъединицы NF-кВ (Abcam, США) в течение 45 мин ивторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa 488 (козьиантитела к иммуноглобулинам кролика; Abcam, США) в течение 60 мин стрехкратной промывкой 0,1 % Tween в ФСР после каждой инкубации. Длявыявленияструктурыактиновогоцитоскелетараспластанныхклетокпроводили окраску родамин-фаллоидином (Sigma, USA) 10 мин при 37°С.В качестве заключающей среды использовали Prolong Gold antifade reagentwith DAPI (Invitrogen, США).

Препараты анализировали с помощьюфлуоресцентного микроскопа AxioScope A1 (Zeiss, ФРГ). Для возбужденияфлуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм дляFITС, HeNe лазер с длиной волны 543 нм для родамин-фаллоидина. Применялираздельное сканирование для сигнала FITC (флуоресценция в области 500-530нм) и CY3 (флуоресценция в области 580-640 нм) (Romijn et al., 1999).Совмещение двух сигналов FITC и CY3 (Merge) проводили с помощьюкомпьютерной программы Axiovision Rel 4.8.452.16. Статистическая обработка результатов.Статистическую обработку результатов проводили с использованиемпрограмм “Excel” для WinXP и Graph Pad Prism 5.0.

В качестве характеристикиспользовали среднее и стандартное отклонение.В экспериментах по изучению влияния МСК на аллерген-специфическиереакциилейкоцитовоценивалимежгрупповыеразличияU критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимостиспомощьюp< 0,05.Для сравнения результатов сокультивирования были использованы средниезначения интенсивности флуоресценции в относительных единицах (Хсредн).46Глава 3. Результаты3.1.

Особенности получения МСК из пупочного канатикаВ ходе работы было получено и проанализировано 78 культур МСК изпериваскулярного пространства пупочной вены пупочного канатика. Благодаряпроведенной нами оптимизации методики выделения клеток из этой нишивозможно получение чистой популяции МСК, лишенной или с минимальнойпримесью эндотелиоцитов, которые удаляются при первом пассировании.В среднем, эффективность получения МСК после 1 пассажа составляет 3,1млн (с минимумом – 0,7и максимумом – 5,4) на каждые 10 см длиныпупочного канатика. Учитывая, что описанные культуры МСК получали изпериваскулярного пространства пупочной вены, значимой характеристикойявляется именно длина образца пупочного канатика, а не его вес. Размеробразцов пупочного канатика в среднем составлял 20 см (минимальный размер– 7 см, максимальный – 40 см).

Таким образом, после 1 пассажа из одногообразца пупочного канатика в среднем можно получить порядка 6 млн МСК.Аналогичное количество МСК можно получить из 50-70 мл костного мозга,либо из 3-5 мл жировой ткани.Количество жизнеспособных и пролиферирующих МСК, которые можновыделить из образца пупочного канатика, зависит от величины временногопромежутка между родами и началом обработки материала.

Если данныйинтервал составляет менее 7 часов, то среднее количество МСК после 1пассажа составляет – 3,85 млн на каждые 10 см пупочного канатика. ПриувеличениивременногоинтервалаэффективностьвыделенияМСКзначительно снижается (Рис.3.1).47Количество клеток, млн65432102-7ч8-14ч15-19ч20-25чРисунок 3.1. Зависимость среднего количество МСК от временногопромежутка между родами и обработкой материала. По оси ординат – среднееколичество МСК после 1 пассажа в млн клеток в пересчете на 10 см образцапупочного канатика.ТакжебылавыявленазависимостьколичестваМСКотполановорожденного. Среднее количество МСК после 1 пассажа в пересчете на 10см было выше при обработке пупочных канатиков новорожденных мужскогопола (41 образец) по сравнению с пупочными канатиками новорожденныхКоличество клеток, млн.женского пола (37 образцов) (Рис.3.2.).6543210женмужРисунок 3.2.

Среднее количество МСК, выделенных из образцов пупочногокантика новорожденных женского (жен) и мужского (муж) пола. По осиординат – среднее количество МСК в млн клеток в пересчете на 10 см образцапупочного канатика.48Дополнительно проанализировали 8 культур МСК, полученных при родахчетырех пар разнополых близнецов. В трех парах наибольшее количество МСКбылополученоизобразцапупочногоканатика,соответствующемуноворожденному мужского пола. Для пары близнецов № 3 различия вколичестве МСК между образцами не были выявлены. (Рис.3.3.)Количество, млн4муж3,5жен32,521,510,501234Рисунок 3.3. Количество МСК, выделенных из образцов пупочных кантиковчетырех пар близнецов.

По оси ординат – количество МСК в млн клеток впересчете на 10 см образца пупочного канатика, по оси абсцисс – номер парблизнецов.В тоже время количество МСК не зависело от возраста роженицы и срокагестации (37-41 неделя).Таким образом, можно говорить о высоком содержании МСК впериваскулярном пространстве пупочного канатика. Эффективность полученияМСК из пупочного канатика сильно варьирует между образцами, и, в первуюочередь, зависит от временного интервала между родами и началом обработкиматериала.3.2. Сравнение свойств МСК, культивируемых в нормоксии или в гипоксииДля выбора схемы культивирования мы провели серию собственныхэкспериментов по сравнению характеристик МСК при культивировании вусловиях нормоксии (концентрация кислорода 20%) и гипоксии (5%).

Вкачестве критериев для сравнения использовали время удвоения популяции,49иммунофенотип (оценивали на 3 пассаже) и морфологические характеристикиМСК (размер и форма клеток).СравнениехарактеристикМСКприкультивированиивусловияхнормоксии и гипоксии проводили для 5 культур костного мозга, 4 культуржировой ткани и 7 культур пупочного канатика.ПоморфологическимхарактеристикампопуляцияМСКявляетсягетерогенной, вне зависимости от источников получения. Морфологию клетокоценивали на 2-7 пассаже при степени конфлюентности 60-75%. В началекультивирования в популяции обычно присутствуют фибробласто-подобныеклетки размером 25-60 мкм, а также вытянутыеверетеновидные клетки слинейными размерами 50-100 мкм.

После 3 пассажа в популяции появляютсяболее крупные клетки (100 - 250 мкм)полигональной формы с большимколичеством отростков (Рис.3.4.).АБРисунок 3.4. МСК полигональной формы с отростками (отмеченыстрелками) в культурах, полученных из жировой ткани (А, интерференционноконтрастная микроскопия) и костного мозга (Б, световая микроскопия).Культивирование в условиях нормоксии, 3 пассаж. Шкала – 50 мкм.Культивирование в условиях гипоксии не приводило к существенномуизменению морфологических характеристик МСК (Рис.3.5.)., но сказывалосьна соотношении клеток с перечисленными выше типами морфологии.5020%5%123Рисунок 3.5.

Общий вид культур МСК, полученных из костного мозга (1),жировой ткани (2) и пупочного канатика (3) при культивировании в условияхнормоксии (20%) и гипоксии (5%). Темные округленные клетки – МСК,находящиеся на стадии митотического деления. Шкала – 100 мкм.51В условиях гипоксии снижается содержание крупных клеток полигональнойформывпопуляцииМСК(Рис.3.6).СредниеразмерыМСКприкультивировании в гипоксических условиях меньше, чем при культивированиис 20% кислорода (Таблица 3.1.).

Средние размеры МСК, полученных изкостного мозга, достоверно выше по сравнению с МСК из жировой ткани ипупочного канатика.Рисунок 3.6. Соотношение МСК с различной морфологией в культурах,полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, прикультивировании в условиях нормоксии (20%) и гипоксии (5%).