Автореферат (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце)

На правах рукописиКРАВЦОВАВиолетта ВасильевнаФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬNa,K-АТФазы В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степенидоктора биологических наук03.03.01 – физиологияСанкт-Петербург2018Работа выполнена на кафедре общей физиологии биологического факультетаФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет».Научный консультант:Кривой Игорь Ильич, доктор биологических наук, профессор кафедрыобщей физиологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственныйуниверситет».Официальные оппоненты:Юрий Петрович Герасименко, член-корр.

РАН, доктор биологических наук,профессор, заведующий лабораторией физиологии движения, ФГБУН Институтфизиологии имени И.П. Павлова РАН.Денис Борисович Тихонов, чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,заведующий лабораторией биофизики синаптических процессов, ФГБУНИнститут эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.Ольга Сергеевна Тарасова, доктор биологических наук, профессор кафедрыфизиологии человека и животных биологического факультета, ФГБОУ ВО«Московский государственный университет имени М.В.

Ломоносова».Ведущая организация – ФГБУН ГНЦ РФ – Институт медико-биологическихпроблем РАН.Защита состоится ""2018 г. в "" часов на заседанииДиссертационного совета Д 212.232.10 по защите докторских и кандидатскихдиссертаций при ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.

А.М. Горького ФГБОУ ВО«Санкт-Петербургский государственный университет» по адресу: 199034, СанктПетербург, Университетская наб., 7/9, а также на сайте Санкт-Петербургскогогосударственногоуниверситета:https://disser.spbu.ru/disser/soiskatelyu-uchjonojstepeni/dis-list/details/14/1640.htmlАвтореферат разослан "2018 года"Ученый секретарь Диссертационного советадоктор биологических наук, профессор2Н.П. АлексеевОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальностьтемыисследования.Двигательнаяактивность,обеспечиваемая скелетной мускулатурой, является важным факторомполноценного качества жизни (Gerasimenko et al., 2016; Radak et al., 2016).

Приинтенсивной двигательной активности происходит снижение трансмембранныхградиентов Na+ и К+, что может привести к нарушениям в пресинаптическом имышечном звеньях нервно-мышечной передачи, снижению работоспособностии утомлению (Matyushkin et al., 1995; Sejersted, Sjøgaard, 2000; Clausen, 2003;2015; DiFranco et al., 2015). Среди механизмов поддержания мышечногоэлектрогенеза и сократительной функции (Kristensen, Juel, 2010; Matchkov,2010; Shestopalov et al., 2017) важнейшую роль играет активность Na,KАТФазы. Эта ферментная система, открытая д-ром J. Skou (Skou, 1957)(Нобелевская премия по химии 1997 г.), является интегральным белком,поддерживающим трансмембранные градиенты Na+ и K+ за счет их активноготранспорта, что обеспечивает электрогенез, возбудимость, а также рядсопряженных транспортных механизмов клетки (Blanco, Mercer, 1998;Mobasheri et al., 2000; Sejersted, Sjogaard, 2000; Clausen et al., 2017).

Скелетныемышцы содержат основной пул Na,K-АТФазы, плотность распределениякоторой в сарколемме достигает 1000 – 3350/мкм2, благодаря чему этот пулNa,K-АТФазы чрезвычайно важен для поддержания калиевого гомеостазисавсего организма (Clausen, 2003).Na,K-АТФаза состоит из -субъединицы, выполняющей каталитическую итранспортную функции, β-субъединицы, в основном функционирующей вкачестве шаперона, а также включает ассоциированный белок семейства FXYD,являющийся модулятором активности фермента (Mijatovic et al., 2007;Pirkmajer, Chibalin, 2016; Clausen et al., 2017). Внеклеточные участки субъединицы Na,K-ATФазы формируют специфический сайт связывания(рецептор) для кардиотонических стероидов являющихся ингибиторами Na,KАТФазы и имеющих эндогенные циркулирующие аналоги (Mijatovic et al.,2007; Bagrov et al., 2009; Lingrel, 2010; Blaustein, 2017).Na,K-АТФаза экспрессируется в различных молекулярных формах.

Длямлекопитающих известны четыре изоформы -субъединицы (1 – 4), триизоформы β-субъединицы Na,K-АТФазы, а также семь белков семейства FXYD(Blanco, Mercer, 1998; Pirkmajer, Chibalin, 2016; Clausen et al., 2017), чтообеспечивает широкое молекулярное и функциональное разнообразие Na,KАТФазы. Клетки большинства тканей, помимо изоформы 1, выполняющейосновную насосную функцию, экспрессируют также одну из изоформ 2 – 4,3которые выполняют специфические для данной клетки функции.Важно, что функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы обусловлена нетолько её молекулярным разнообразием, но также специфической мембраннойлокализацией, особенностями регуляции и взаимодействием с белковым илипидным окружением (обзоры: Кривой, 2014; Matchkov, Krivoi, 2016).Благодаря ряду структурных доменов Na,K-АТФаза участвует в качествескаффолдавформированиифункциональныхмультимолекулярныхкомплексов, за счет чего достигается регуляция самых разнообразных свойствклетки, реализуется модуляция самой Na,K-АТФазы и её сигнальная функция(Крылов и др., 1999; Xie, Askari, 2002; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007; Reinhard etal., 2013).В скелетных мышцах ко-экспрессируются 1- и 2-изоформы Na,KАТФазы,физиологическаяроль,особенностилокализацииифункционирования которых являются предметом интенсивного изучения(Кривой, 2012; Matchkov, Krivoi, 2016; Pirkmajer, Chibalin, 2016; Kutz et al.,2018).

К наиболее принципиально важным и нерешенным относятсяследующие вопросы.1. Хотя фракция 2-изоформы доминирует и достигает 87% от общегоколичества Na,K-АТФазы в скелетной мышце (Orlowski, Lingrel, 1988; He et al.,2001), она в покое малоактивна и базовую насосную функцию в основномвыполняет 1-изоформа (Krivoi et al., 2003; Heiny et al., 2010). Однако показанаважная роль локализованного в Т-системе пула 2-изоформы в поддержаниимышечной работоспособности при интенсивной нагрузке, когда происходитнакопление К+ в узких пространствах Т-системы (Radzyukevich et al., 2013;DiFranco et al., 2015). Особенности локализации, функционирования ирегуляции 2-изоформы Na,K-АТФазы в постсинаптической области мембраны(концевая пластинка) не исследованы.2.

Выявлены функциональные и межмолекулярные взаимодействия междуNa,K-АТФазой и белками (рецепторы, транспортеры и др.), вовлеченными врегуляцию синаптической функции (Hazelwood et al., 2008; Matos et al., 2013;Illarionava et al., 2014), включая взаимодействие с никотиновымихолинорецепторами (Кривой и др., 2004; Park et al., 2010; Bao et al., 2015;Matchkov, Krivoi, 2016), механизм которого требует специального анализа.3.

Роль холестерина в компартментализации, стабилизации и регуляцииNa,K-АТФазы изучена достаточно подробно (Chen et al., 2011; Haviv et al.,2013; Cornelius et al., 2015), однако изоформ-специфичность этихвзаимодействий во многом остается неясной и исследована в основном наэкспрессионных клеточных системах (Lifshitz et al., 2007; Kapri-Pardes et al.,42011). На скелетной мышце подобные исследования не проводили.4.Немногочисленныеданныесвидетельствуютобизоформспецифичности влияния двигательной активности в отношении Na,K-АТФазы ив основном касаются долговременных нарушений, связанных с травмами ивозрастом (Clausen, 2013; Wyckelsma, McKenna, 2016). Только начинаетизучаться функционирование Na,K-АТФазы в скелетных мышцахгибернирующих животных (Guo et al., 2017).

Факты серьезных нарушений впостуральных мышцах в ходе космического полета (гравитационная,двигательная разгрузка) (Шенкман,2016: Kozlovskaya et al., 1988) такженастоятельно требуют подобных исследований, причем, с точки зрения поискаключевых сигнальных событий, запускающих атрофическую программу,особый интерес представляет начальный этап двигательной разгрузки(Vilchinskaya et al., 2017).5. Ультраструктура концевой пластинки пластична и ее нарушениянаблюдаются после продолжительной двигательной разгрузки при возрастныхизменениях, миодистрофии и других формах мышечной патологии (Nishimuneet al., 2014; Tintignac et al., 2015; Rogers, Nishimune, 2017); структурныеизменения на начальных этапах двигательной дисфункции не изучены.6.

Хорошо известна изоформ-специфичность регуляции 2-изоформыNa,K-АТФазы скелетных мышц тиреоидными гормонами, инсулином,глюкокортикоидами и др. Однако лишь единичные исследования посвященыизучению эффектов эндогенных кардиотонических стероидов в скелетныхмышцах (Radzyukevich et al., 2009), хотя этот вопрос детально разработан вотношении сердечной и гладкой мышц (Blaustein et al., 2016).Цель настоящей работы – исследование функционального разнообразияNa,K-АТФазы в скелетной мышце, основанного на особенностях локализации,регуляции и функциональных взаимодействий с молекулярным окружением1- и 2-изоформ ее -субъединицы.Основные задачи исследования:1) Исследовать особенности локализации 2-изоформы Na,K-АТФазы вобласти концевой пластинки и её функционального взаимодействия сникотиновыми холинорецепторами.2) Исследовать возможность влияния циркулирующего никотина нафункционирование Na,K-АТФазы в скелетной мышце.3) Изучить возможность функционального взаимодействия между 2изоформой Na,K-АТФазы и мембранным холестерином.4) Исследовать изоформ-специфичность влияния двигательной разгрузки вотношении Na,K-АТФазы в период, предшествующий развитию атрофии.55) Исследовать возможность структурных нарушений концевой пластинкина ранних этапах двигательной разгрузки.6) Проверить возможность регуляции сократительной функции скелетноймышцы кардиотоническими стероидами в концентрациях, соответствующихуровню их циркулирующих эндогенных аналогов.Положения, выносимые на защиту:1) Особенностью распределения и функционирования 2-изоформы Na,KАТФазы является локализация одного из её пулов в области концевойпластинки и участие в специализированном физиологическом механизмеподдержания постсинаптического электрогенеза.2) Изоформ-специфичность 2-изоформы Na,K-АТФазы проявляется в еёфункциональных взаимодействиях с никотиновыми холинорецепторами имембранным холестерином, специфической зависимости от двигательнойактивности, а также в регуляции мышечного сокращения кардиотоническимистероидами.3) В скелетной мышце 1-изоформа Na,K-АТФазы функциональностабильна по сравнению с 2-изоформой, адаптационная пластичность которойопределяется изоформ-специфичностью локализации и регуляции её различныхпулов, а также функциональных взаимодействий с молекулярным окружением.Научная новизна.