Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 7

Для этоговводится параметр c:c  K a  M tot ,гдеKa– константа связывания, аM tot –полная(2.17)концентрация мест связывания.Параметр с должен лежать в пределах от 10 до 100.Из-за ограничений в чувствительности приборов, могут быть изучены лишьбиологические реакции, проходящие с относительно сильными тепловымиэффектами [123].Калориметр содержит две ячейки: одна для исследуемого раствора, другая –ячейка сравнения. Перед началом эксперимента, все исследуемые растворызаливаются в соответствующие ячейки, задается необходимая температура, и всекомпоненты выводятся в состояние теплового равновесия относительно другдруга.В представленных в работе экспериментах в ячейку заливалось 1.4 млраствора необходимой концентрации ДНК, в шприце находилось 250 мклрастворалиганда,нужнойконцентрации,температураподдерживаласьпостоянной и равной 21°С, скорость смешения 250 об/мин.Через равные промежутки времени (500 секунд), одинаковые по объемуинъекции лиганда (6.86 мкл) вливаются в раствор ДНК, происходящее при этом40выделение или поглощение теплоты фиксируется прибором.

Следует отметить,что промежутки времени подобраны таким образом, чтобы система успевалаприйти в состояние равновесия перед следующей инъекцией.В результате эксперимента мы получаем зависимость выделенной илипоглощенной в результате реакции теплоты от времени. Зная концентрациивеществ после каждой инъекции можно построить зависимость теплоты отсоотношения концентраций лиганд-ДНК.Для исключения тепловых эффектов, возникающих при разбавленииинъектанта, проводится эксперимент, в котором исследуемый лиганд при всехпрочих равных условиях вливают в растворитель. Полученные при этом тепловыеэффекты затем вычитаются из основного эксперимента.Анализ полученных зависимостей проводился при помощи программыOrigin 8.0 по уравнению (2.16) для модели «одна молекула лиганда-одно местосвязывания», а также с использованием предустановленного программногообеспечения для использованного микрокалориметра по модели с двумянезависимыми типами связывания.ВданнойработедляпроведенияэкспериментовиспользовалсяМикрокалориметр титрования TA Instruments Nano ITC 2G, находящийся в РЦСПбГУ «Термогравиметрические и калориметрические методы исследования»(рис.

2.1).Рис. 2.1. Микрокалориметр титрования TA Instruments Nano ITC 2G.412.4. Вискозиметрия как метод исследования изменениймакромолекулярных параметров ДНК при комплексообразованииИспользование метода визкозиметрии основано на том, что взаимодействиес ДНК многих биологически активных лигандов приводит к изменению размерови формы макромолекулы в целом. Эти изменения зависят от способа связываниямолекулы лиганда с ДНК. Молекулы ДНК, находящиеся в растворе, сворачиваясь,формируют третичную структуру, которую можно моделировать свободносочлененной цепью [124], состоящей из одинаковых сегментов.

Контурная длинамакромолекулы определяется какL = NA,(2.18)где N – число сегментов в макромолекуле, A – длина сегмента, которая являетсямерой термодинамической жесткости ДНК.Если макромолекулу можно считать гауссовым клубком (при большихзначенияхN),топлотностьвероятностирасстояниямеждуконцамимакромолекулы (h0) описывается гауссовым распределением:3h 22W (h0 ) ~ e 2 h0 ,(2.19)Тогда среднее квадратичное расстояние между концами цепи определяетсякак:h0  LA  NA2 ,2(2.20)Но реальная цепь отличается от модели свободно-сочлененной цепи преждевсего тем, что в случае сближения далеких по цепи атомов на расстояние,меньшее сумма их Ван-дер-Ваальсовых радиусов, возникают силы отталкивания,происходит набухание клубков. При этом распределение в клубках перестаетбыть гауссовым, и среднеквадратичное расстояние между концами становитсяравным:h 2  h0   2 ,2(2.21)где α – коэффициент линейного набухания, зависящий от качества растворителя.42Вязкостью жидкости называют коэффициент пропорциональности междуградиентом скорости потока g (g=dU/dz) и напряжением сдвига .

В условияхламинарного потока это соотношение выражается формулой Ньютона:τ =ηg ,(2.22)где  – коэффициент вязкости или просто вязкость жидкости.Жидкости, для которых  не зависит от величины g, называютньютоновыми. Для неньютоновых жидкостей: = f(g,r),(2.23)В случае растворов вязкость жидкости определяется не только трениемслоев растворителя при течении, но и вращательным движением растворенноговещества. Мерой рассеяния энергии, обусловленного вращением макромолекул вламинарном потоке, является величина характеристической вязкости:   0    1  lim  r,g0 C C0C0C0  limg 0 где 0 – вязкость растворителя,  –вязкость раствора, С –раствора, r – его относительная вязкость (  r (2.24)концентрация).0Характеристическая вязкость имеет размерность удельного объема (м3/кг).Концентрационная зависимость приведенной вязкости описывается формулойХаггинса [125]:r  1Cгдеr  1CspC   k '  C ....

,2(2.25)– приведенная вязкость, ηsp=ηr-1 – специфическая вязкость.Константа Хаггинса k практически не зависит от молекулярной массыполимера. В -растворителе она может быть порядка 0.5 или выше, а сулучшением качества растворителя достигает значения k = 0.20.3.43Специфическая вязкость sp  r  1 измеряется при разных градиентахскорости потока и концентрациях, а затем проводится экстраполяция величиныприведенной вязкости (Величина r  1C)g0 к значению при С0.пропорциональна удельному объему макромолекулы врастворе.

Различные теории вязкости [126] приводят к следующему общемусоотношению:ART   D M0,(2.26)rгде R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура,Dr – коэффициент вращательной диффузии, А – коэффициент, зависящий отвыбора модели макромолекулы.Например, для эллипсоида вращения справедливо:AF p,6(2.27)где F(p) – фактор формы, р – отношение главных осей эллипсоида.Для полимеров гомологического ряда существует эмпирическая формулаМарка-Куна-Хаувинка [127]:   kMa,(2.28)где k и a – постоянные, характеризующие данную систему полимер-растворитель.Значение величины а для клубкообразных молекул лежит в интервале0.5а 0.8. Для палочкообразных частиц а  1.Для высокомолекулярной ДНК, выделенной из разных источников, вводно-солевом растворе физиологической ионной силы (0.15М NaCl) формула(2.28) имеет вид:   6.9 104  M 0,7 (дл/г).Согласно Флори, значения а, превышающие 0.5, обусловлены набуханиеммакромолекул в хороших растворителях.

В случае идеального растворителя,величина а = 0,5 для разных полимеров в широкой области молекулярных масс.44Согласно Флори [128], характеристическая вязкость макромолекулы связана с еепараметрами соотношением:2 3/ 2   Ф (h0 )M3 ,(2.29)где Ф – константа Флори для данной системы полимер-растворитель, М –молекулярная масса,  – коэффициент линейного набухания, равный отношениюсреднеквадратичных расстояний между концамиреальной и идеальной1/ 2 h2 макромолекулы:    2 h 0 .Таким образом, теория метода устанавливает зависимость [η] от параметровконкретных моделей, которыми можно аппроксимировать растворённые частицы(макромолекулы).

Такими моделями могут быть эллипсоиды вращения, жёсткиепалочки, в случае цепных макромолекул удобно использовать модель клубкасвободно-сочленённой или червеобразной цепи. Каждая из этих моделей имеетсвои параметры. Для статистическихклубков таким параметром являетсясреднеквадратичное расстояние между концами цепи. Для свободносочленненойцепи:h02=LA,(2.30)где L – контурная длина, А – длина статистического сегмента.Для червеобразной цепи [129]:h02L a1 e a 2aL 1  L  ,(2.31)где а – персистентная длина.Следовательно, в случае высокомолекулярной ДНК при использованиимодели клубка одно только определение [η] при комплексообразовании не даётвозможности вычислить изменение контурной длины, так как всегда возможнопараллельное изменение термодинамической жёсткости цепи при связывании, т.е.изменение длины статистического сегмента или персистентной длины.

Одним изспособовпреодоленияэтогоположенияявляетсяиспользованиефрагментированной ультразвуком низкомолекулярной ДНК, у которой контурная45длина оказывается меньше, чем длина статистического сегмента. В этом случаемолекулу ДНК можно аппроксимировать жёстким или изогнутым стержнем ипользоваться выражением (2.18) для определения изменения контурной длинымакромолекулыприеёвысокомолекулярнойтермодинамическойвзаимодействииДНКснеобходиможествостицепиДНКлигандом.Вопределятьприслучаеизменениеобразованиикомплексанезависимым методом.Растворы ДНК-лиганд являются, как правило, неньютоновыми жидкостями,т.е. для них величина  зависит от градиента скорости потока g. Поэтому приизмерении относительной вязкости r необходимо учитывать зависимость r(g) иопределять (r)g=0 экстраполяцией к g0. Для корректной экстраполяциинеобходимо проводить измерения при низких градиентах скорости.

Такие условиямогутбытьреализованывнизко-градиентноммагнитномротационномвискозиметре. При использовании таких вискозиметров обеспечивается условие:g  (0,0120) сек-1. Используемый вискозиметр с постоянными магнитами описанвработе[130].Посколькухарактеристическаявязкостьявляетсяэкстраполяционной величиной и для ее получения проводятся концентрационныеизмерения, необходимо, чтобы при изменении концентрации макромолекулы врастворе не происходили изменения в ее конформации.