Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 8

Для этогонеобходимосохранять равновесные значения концентрации противоионов и свободноголиганда. Критерием сохранения конформации ДНК при разбавлении раствораявляется прямолинейность зависимостиr  1Cот С.2.5. Двойное лучепреломление в потокеПоскольку гидродинамические свойства высокомолекулярной ДНК, как илюбой цепной молекулы, зависят, по крайней мере, от двух макромолекулярныхпараметров:контурнойдлиныидлиныстатистическогосегмента,дляопределения способа связывания лиганда с ДНК недостаточно определенияизменения характеристической вязкости макромолекулы при связывании слигандами. Необходимо независимое определение изменения термодинамической46жесткости цепи ДНК при образовании комплекса.

Одним из немногихсуществующихметодовопределенияэтогопараметраявляетсяметоддинамического двойного лучепреломления.Теория методаПри помещении раствора полимера в поле градиента скорости онстановитсяоптическилучепреломлениеанизотропным,(эффектМаксвелла)возникающееявляетсяприэтомрезультатомдвойноеориентациисегментов. Эти ориентации взаимно коррелированны по объему макромолекулы,так как механические силы потока вызывают поступательное и вращательноедвижение, а также деформацию молекулы как целого. Эффект Максвелла враствореполимераопределяетсягеометрическими,механическимииоптическими свойствами растворенных макромолекул, и его изучение даетсведения об их структуре. Двойное лучепреломление (ДЛП) наблюдают,пропуская свет через исследуемый раствор, находящийся между двумякоаксиальными цилиндрами.

Один из них равномерно вращается, создаваяламинарный поток с градиентом скорости, направленным по радиусу цилиндра(рис.2.2).Рис. 2.2. Поле градиента скорости в жидком слое, заключенном междустенками неподвижного (1), вращающегося (2) цилиндров.Под действием напряжений сдвига в потоке появляется преимущественнаяориентация молекул, и жидкость становится оптически анизотропной. При этом,для светового пучка, параллельного образующей цилиндра и перпендикулярногонаправлениям градиента скорости g и скорости потока u, раствор ведет себяподобно одноосному кристаллу, главное сечение которого образует угол φ с47направлением потока u. Этот угол называют углом ориентации.

При изучениидинамического двойного лучепреломления кроме φ изучают величину разностидвух главных показателей преломления Δn=n1-n2, соответствующих лучам,поляризованным в плоскости главного сечения (n1) и перпендикулярно к ней (n2),Δn характеризует величину двойного лучепреломления и может быть какположительным, так и отрицательным. Для характеристики величины двойноголучепреломления вводится динамооптическая постоянная:nglimn ,(2.32)c 0  cg 0 0где с – концентрация раствора, η0 – вязкость растворителя.Уголориентации,восновном,определяетсямеханическимиигеометрическими свойствами частиц [131].Петерлин [132,133] развил теорию двойного лучепреломления растворовдля эллипсоидных частиц.Оптическиесвойствачастицыопределяютсятремяееглавнымиполяризуемостями γ1, γ2 и γ3 (по трем главным осям).

Обычно молекулеприписывают одноосную симметрию оптических свойств, то есть считают γ2= γ3,и предполагают, что оптическая и геометрическая оси частицы совпадают [133].Разность двух главных показателей преломления анизотропного раствораΔn=n1-n2=nx-ny для лучей, поляризованных соответственно по осям x и y, связанасо средней разностью поляризуемостей частицы в тех же направлениях:n  n x  n y 2N x  y ,n(2.33)где N – количество частиц в единице объема, n – показатель преломленияраствора.Величина [n], определяемая при изучении двойного лучепреломления впотоке, является суммой слагаемых:nlimgn  [ n]c 0  cg 0 0e [n] f  n microf ,(2.34)48где[n]e–динамооптическаяпостоянная,обусловленнаясобственнойанизотропией, [n]f – динамооптическая постоянная, обусловленная эффектомформы, [n]microf – динамооптическая постоянная, обусловленная эффектоммикроформы.Собственная анизотропия цепной макромолекулы обусловлена наличиемпреимущественной ориентации сегментов внутри молекулярного клубка иопределяется анизотропией поляризуемости сегмента.

Поляризуемость сегментаможно характеризовать двумя главными значениями α1 и α2 соответственно вдольи поперек его оси.Разность главных поляризуемостей (γ1-γ2) пропорциональна анизотропиисегмента  1   2  и является функцией величины h/NA.При h <<NA можно записать:1   2 3 1   2  h 5 NA 2,(2.35)Для недеформированной гауссовой цепи в равновесном состоянииh 2  NA 2иразность поляризуемостей цепи определяется анизотропией сегмента:1   2 3 1   2  ,5(2.36)И т.к. сегмент аппроксимируется жесткой палочкой: 1   2   S a II a  ,(2.37)где S – число мономеров в сегменте, aII  a  – разность поляризуемостеймономерного звена вдоль и перпендикулярно направлению цепи.Представленные теоретические исследования растворов макромолекул неучитывают межмолекулярные взаимодействия и поэтому применимы лишь кпредельноразбавленнымрастворамиликэкспериментальнымданным,полученным при экстраполяции к бесконечному разбавлению.

Петерлин [134]предложилполуэмпирическуюгидродинамическоеПетерлину:зависимость,взаимодействиепозволяющуюмакромолекулврастворе.исключитьСогласно49 n n   g  g 0     0 ,(2.38)В системах, не обладающих эффектом формы (присущим несферическимчастицам и зависящим от отношения осей эллипсоида и разности показателейпреломления частицы и растворителя), отношение n  g   0 остается постоянным вширокой области концентраций полимера и совпадает с величиной [n]/[η][135,136].

Для ДНК эффект формы мал по сравнению с большой собственнойанизотропией, поэтому отношение (2.38) можно использовать для определенияоптической анизотропии молекулы ДНК и ее комплексов.Методдинамическогодвойноголучепреломленияпозволяетэкспериментально определить сегментную анизотропию  1   2  . Если структурамономерного звена полимера известна, то сопоставление экспериментальногозначения 1   2 ивычисленнойпосхеметензорнойаддитивностиполяризуемостей величины a II  a   дает возможность оценить количествомономеров в сегменте и тем самым определить длину статистического сегмента,т.е.

термодинамическую жесткость цепи.Использованиеэтоготермодинамическойжесткостиметодапозволяетмакромолекулыопределитьприразличныхизменениеспособахсвязывания лиганда с ДНКИзменение оптической анизотропии ДНК при образовании комплексаможет быть вызвано изменением длины статистического сегмента и/или среднейвеличины оптической анизотропии мономерного звена. n  g    0   r n A a||  a  r  r , g    0   0 A0 a||  a  0(2.39)Здесь и далее индексы «0» и «r» обозначают параметр, относящийся ксвободной ДНК и к комплексу со стехиомтрией r, соответственно.Следовательно,50,(2.40)В случае интеркаляционного связывания, средняя величина оптическойанизотропии мономерного звена выражается по формуле:aгде a II a  l|| a  r a|| a  0  r  a||  a  l1 r,(2.41)– оптическая анизотропия лиганда в собственных осях, котораярассчитывается по схеме тензорной аддитивности поляризуемостей валентныхсвязей.В случае же расположения молекулы лиганда в бороздке:a|| a  r  a||  a  0  r a||  a  l 3 cos 2   1,2(2.42)где β – угол ориентации плоскости хромофора относительно оси двойной спиралиДНК.Оптическая схема установки для измерения величины динамическогодвойного лучепреломления описана в работе [137].Для определения способа связывания лигандов с ДНК была примененаметодика определения удлинения цепи ДНК с использованием методоввискозиметрии и ДЛП [13].

Согласно этой методике проводилось определениеотносительного изменения характеристической вязкости и длины статистическогосегмента макромолекулы при образовании комплекса ДНК-лиганд. Зная этивеличины, можно рассчитать величину изменения контурной длины:Lr/L0= ([η]r/ [η]0)2/3·A0/Ar,(2.43)и тем самым установить или исключить интеркаляционную модель связывания.Одновременно эта методика дает значение изменения термодинамическойжесткости макромолекулы при образовании комплекса.2.6. Приготовление растворов комплексов ДНК-лиганд иособенности их гидродинамического поведенияДля проведения спектральных и гидродинамических исследованийкомплексы готовились путем прямого смешения исходных растворов ДНК и51лиганда,соответствующихконцентраций.Вкачестверастворителяиспользовались водно-солевые растворы NaCl.

Поскольку для получениягидродинамических параметров комплексов необходимы концентрационныеизмерения,исходныерастворыкомплексовдолжныиметьмаксимальнодопустимую концентрацию ДНК. В процессе определения такой концентрациибыло обнаружено, что при определенных условиях: концентрация ДНК,концентрация лиганда и ионная сила раствора, взаимодействие лиганда с ДНКприводит к возникновению особенностей в гидродинамическом поведенииисследуемых растворов [138].Для изучения этих особенностей было произведено исследование [138]гидродинамическогоповедениярастворовкомплексовДНКсподробноизученными ранее [139] производными актиноцина, имеющими разную длинуалкильной цепи (рис.2.3) в зависимости от условий приготовления растворовкомплексов.R(CH2)nNHNHCOCO N(CH2)nRСоед.