Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 9

1 R=N(C2H5)2, n=2Соед. 2 R=N(C2H5)2, n=3NH2Соед. 3 R=N(CH3)2, n=2Соед. 4 R=N(CH3)2, n=3OCH3OCH3Соед. 5 R=NH3, n=2 Рис.2.3. Структура производных актиноцина.Данные соединения хорошо растворимы в воде. Соединения былисинтезированы в Санкт-Петербургском технологическом университете[140]. Всесоединения активно связываются с ДНК, являясь классическими интеркаляторами[139].Концентрация ДНК в исходных растворах комплексов имела два значения:CДНК = 8·10-3% и CДНК = 4·10-3%.

Ее характеристическая вязкость при ионной силераствора 0.001М равна 20.0 м3/кг. Нетрудно видеть, что в первом случае52[η]ДНК·CДНК>1, что говорит о перекрывании макромолекулярных клубков врастворе (полу-разбавленный раствор). Во втором случае [η]ДНК·CДНК<1, чтосоответствует условию разбавленных растворов.При соотношении концентраций лиганд-ДНК r=0.1 и ионной силе 0.001Мбыли проведены эксперименты по измерению вязкости растворов для комплексовлиганд-ДНК всех соединений.

Результаты измерений зависимости вязкости отконцентрации ДНК в растворе представлены на рис. 2.4.353023 r-1)/C ДНК,м /кг251201510500,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0-3CДНК,10 %Рис. 2.4. Зависимость ηr-1/Сднк от концентрации ДНК, 1- чистая ДНК, 2комплексы соединений 1-5 с ДНК при r=0.1, μ=0.001.Как видно, для всех комплексов зависимость приведенной вязкости отконцентрации прямолинейна. Для всех исследованных соединений при r=0.1относительное изменение характеристической вязкости составляло 1.25, чтосоответствует классической интеркаляционной модели.Аналогичные измерения были проведены для комплексов с предельномалым содержанием лиганда r=0.01.Результаты измерения зависимости вязкости от концентрации ДНК приr=0.01 представлены на рис.2.5. 53403353r-1)/C ДНК,м /кг3012520241510500,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0-3C ДНК,10 %Рис. 2.5.

Зависимость ηr-1/СДНК от концентрации ДНК, μ=0.001 1– чистаяДНК, 2 – комплексы соединений, приготовленные в условиях разбавленногораствора при r=0.01, 3 – комплексы соединений 1 и 2, приготовленные в условияхполу-разбавленногораствораr=0.01,4–комплексысоединений3-5,приготовленные в условиях полу-разбавленного раствора при r=0.01.Как видно из рис. 2.5, при приготовлении комплексов в условияхразбавленного раствора при соотношении концентраций лиганд-ДНК r=0.01,вязкость растворов комплексов практически неотличима от вязкости растворовсвободной ДНК.

Но при приготовлении комплексов в условиях перекрываниямакромолекулярных клубков и дальнейшем разбавлении наблюдается аномальноеувеличение вязкости для соединений 1 и 2 (при этом зависимость нелинейна). Длясоединений 3-5 способ приготовления растворов не играет роли, увеличениявязкости при данном r=0.01 не наблюдается.Таким образом, мы видиманомальное увеличение вязкости для соединений, содержащих наиболеегромоздкие гидрофобные заместители протонированной аминогруппы группы,при этом длина алкильной цепи не влияет на поведение растворов комплексов.Подобные исследования были проведены для всех соединений при μ=0.1. Вэтих условиях не наблюдалось изменения вязкости растворов комплексов по54сравнению с чистой ДНК при r=0.01, независимо от условий приготовленияисходных растворов комплексов.Следует отметить, что при увеличении градиента скорости в вискозиметредо 0.5 с-1, наблюдаемый аномальный рост вязкости исчезал.Можно предположить, что такое аномальное гидродинамическое поведениерастворов ДНК с производными актиноцина связано с формированиеммежмолекулярных сшивок в процессе приготовления растворов в условияхперекрывания макромолекулярных клубков.

Сохранение этих сшивок придальнейшем разбавлении приводит к аномальному росту вязкости растворов из-заформирования агрегатов, содержащих несколько молекул ДНК. Они сохраняютсяв процессе измерения вязкости лишь при низких градиентах скорости, увеличениеградиента до 0.5 с-1приводит к разрушению сшивок и уменьшению вязкости.Поскольку возникновение сшивок в этом ряду соединений зависит отразмера алкильного заместителя аминогруппы и не зависит от длины алкильнойцепочки,можнопредположить,чтовозникновениесшивоквызваногидрофобными взаимодействиями боковых групп лиганда со сблизившимисяучастками цепи, принадлежащими разным молекулам ДНК.

Подобный типсвязывания возникает только при концентрациях лиганда менее 10-7М и прибольшом избытке мест связывания в растворе.Полученные результаты были использованы нами при дальнейшемисследовании комплексов ДНК с новыми синтетическими производнымиалкалоидов. При приготовлении исходных растворов исключались условиявозможного образования межмолекулярных сшивок.Зависимости(ηr-1)/CДНКотСДНК,используемыедляопределенияхарактеристической вязкости комплексов ДНК-лиганд во всех случаях имелипрямолинейныйхарактер,чтосвидетельствуетосохраненииструктурыкомплекса в процессе разбавления раствора. На рис.

2.6 представлены примерызависимостей (ηr-1)/CДНК от СДНК для свободной ДНК и ее комплексов сисследованными группами соединений. 556560553(r-1)/CДНК,м /кг5045344035ДНК1302521ДНК220151050012345-3CДНК,10 %Рис.2.6. Зависимости приведенной вязкости комплексов лиганд-ДНК ичистой ДНК. Комплексы (1) – соед.

9 и (2) – соед.8 получены с использованиемраствора ДНК2, (3) – соед. 13 и (4) – соед. 16 получены с использованием раствораДНК1.563. Производные изохинолина3.1. Индольные производные изохинолинаВ работе [141] исследовалось взаимодействие молекулы ДНК с тремяиндольнымипроизводнымиизохинолина,химическаяструктуракоторыхразличалась только наличием и положением метильной группы (рис.3.1).Рис. 3.1. Структура индольных производных изохинолина.Соединение 6. В присутствии ДНК в растворе наблюдаются характерныеизменения интенсивности и положения максимума длинноволновой полосыпоглощения соединения, свидетельствующие об образовании комплекса ДНКлиганд (рис.3.2).

Все спектры имеют общую изобестическую точку, что позволяетпредположить один тип связывания этого соединения с ДНК в условияхэксперимента.570,300,25(0.16-0.19)(0.23)(0.28)(0.35)(0.48)(0.61)(0.88)(1.68)0,20D0,150,100,05СДНК=00,00340(3.29-10.67)360380400420440460480нмРис. 3.2. Спектры поглощения при титровании соед.6 при постояннойконцентрации лиганда, равной 4.8·10-5М, 0≤Сднк≤6·10-4М, µ=0.001, цифры вскобках соответствуют значению Слиг/СДНК.Наличие изобестической точки позволяет определить стехиометриюкомплекса, построить кривую связывания этого соединения с ДНК (рис.3.3) ирассчитать параметры связывания: константу связывания и количество местсвязывания, приходящееся на пару оснований ДНК, n=rmax. Изотерма Скэтчардаизображена на рис.

3.4. Параметры связывания, рассчитанные для моделииндентичных невзаимодействующих мест связывания (2.3), приведены в табл. 3.1.0,400,350,300,25r0,200,150,100,050,000,00,51,01,52,02,53,03,54,0Cсвоб , 10-5 МРис. 3.3. Кривая связывания соединения 6 с ДНК.4,55,0585 -1r/Cсвоб , 10 М2,01,51,00,50,00,000,050,100,150,200,250,300,350,40rРис. 3.4. Изотерма связывания соединения 6 с ДНК.Эксперимент по калориметрическому титрованию ДНК соединением 6представлен на рис. 3.5.Рис. 3.5.

Термограмма титрования ДНК соединением 6 при Слиг=6·10-4М,Сднк=1·10-4М, µ=0.001.Результаты ИКТ раствора ДНК растворами соединения 6 представлены нарис. 3.6 в виде зависимости удельной теплоты комплексообразования отсоотношения концентраций лиганд/ДНК. Монотонное уменьшение выделеннойудельной теплоты с ростом соотношения Слиг/CДНК также свидетельствует ободном типе связывания соединения 6 с ДНК.59Q/кол-во в-ва, ккал/моль0,50,0-0,5-1,0-1,5-2,0-2,50,00,20,40,60,81,0C лиг /C ДНКРис.

3.6. Калориметрическая изотерма связывания соединения 6 с ДНК:зависимость удельной теплоты, выделившейся при каждой инъекции соединения,от отношения Слиг/CДНК. Сплошная линия соответствует модели идентичныхнезависимых мест связывания.Результатырасчетатермодинамическихпараметроввзаимодействиясоединения 6 с молекулой ДНК с использованием модели с идентичныминевзаимодействующимиместамисвязывания(2.3),(2.16)приведенывтаблице 3.1. Константа связывания и количество мест связывания по данным СФТзаметно выше соответствующих параметров, вычисленных по данным ИКТ.Можно предположить, что различия в значениях параметров, определенных спомощью СФТ и ИКТ, обусловлены различием в используемых концентрацияхвзаимодействующих компонентов и в процедуре титрования.Таблица 3.1.