Диссертация (Взаимодействие молекулы ДНК с синтетическими аналогами антибиотиков и алкалоидов различной структуры), страница 6

Для этого предполагается, чтолиганд в растворе может существовать только в двух формах – связанной исвободной. Каждой из них соответствует свой коэффициент экстинкции .Экспериментально определяемым, изменяющимся при связывании лигандас ДНК параметром является величина оптической плотности раствора А приданной длине волны .

Если в растворе существует только две спектральноразличимые формы лиганда – свободный и связанный, то наблюдаетсяизобестическая точка – общая точка пересечения всех спектров поглощениярастворов, содержащих одинаковое количество лиганда [L0], независимо отколичества ДНК. Наличие одной изобестической точки указывает, как правило,на существование лишь одного способа связывания лиганда с макромолекулой, тоесть имеется лишь один тип центров связывания, и можно, согласно принципуаддитивности, записать:A  [ L]   своб r [i]   связ,(2.8)В случае ДНК местом связывания для низкомолекулярных лигандовсчитается пара нуклеотидов. Поэтому [i] = СДНК в молях пар оснований.

Еслиимеется несколько различных типов мест связывания, то второй член всоотношении (2.8) должен быть заменен суммой по всем этим типам.Одновременно с соотношением (2.8) рассматривается уравнение материальногобаланса для лиганда:[ L 0 ]  [ L]  r [ i ] ,(2.9)Спол = Ссвоб + Ссвяз ,(2.10)илиСоотношения (2.8) и (2.9) можно рассматривать как два линейныхуравнения с двумя неизвестными [L] и r.

Поэтому возможно определить количествосвязанного и свободного лиганда для каждого раствора.Титрования проводились двумя способами:1 – с независимым приготовлением растворов при Cлиг=const: готовилисерию растворов, содержащих одинаковую концентрацию лиганда и различную34концентрациюДНК.Каждыйизрастворовполучалипутемсливаниясоответствующих объемов растворов лиганда и ДНК, а также водно-солевогорастворителя с заданной величиной ионной силы.2 – титрование «сливанием» при Cлиг=const: готовили два исходныхраствора в водно-солевом растворителе с заданной ионной силой: раствор смаксимальной концентрацией ДНК и с заданной концентрацией лиганда ираствор свободного лиганда, содержащий такую же концентрацию лиганда, что ираствор ДНК-лиганд. Далее, в раствор свободного лиганда последовательнодобавлялся необходимый объем раствора ДНК-лиганд и снимался спектрпоглощения.У всей серии растворов снимали спектры поглощения и при наличииизобестической точки рассчитывали концентрацию свободного и связанноголиганда (2.8), строили изотерму связывания в координатах Скэтчарда (2.3) играфически определяли термодинамические параметры связывания, используямодель с независимыми местами связывания [114] или модель с исключеннымиместами связывания [115].В данной работе все измерения спектров поглощения проводились спомощью спектрофотометров Specord UV Vis и Shimadzu UV-1800.2.2.

Метод кругового дихроизмаДля получения дополнительной информации о наличии взаимодействия и отипе связывания, проводили анализ спектров кругового дихроизма (КД)комплексов ДНК с лигандами.Круговой дихроизм (КД) – спектроскопический метод, основанный наразнице в поглощении лево- и право- поляризованного кругового света, подходитдля анализа молекулярной структуры и взаимодействия хиральных молекул.Использование данного метода весьма удобно и информативно, еслиисследуемые лиганды поглощают свет в видимой области, то есть КД лиганда небудет перекрываться со спектром КД ДНК. В связи с этим, необходимо знатьспектры поглощения исследуемых комплексов. Поэтому измерение спектров КД35или спектрополяриметрическое (СП) титрование проводилось параллельно сописанным выше спектрофотометрическим титрованием.Теория метода кругового дихроизмаЕсли при прохождении света через среду, плоскость его поляризацииповорачивается на некоторый угол, то такая среда называется оптическиактивной.Если разложить плоско-поляризованную волну на лево- и правополяризованные по кругу волны, то при прохождении плоско-поляризованногосветачерезоптическиактивноевеществооднаихэтихволнбудетраспространяться в веществе с большей скоростью, чем другая.

В оптическиактивной среде обе поляризованные по кругу компоненты распространяются сразными скоростями, но оказывается, что в такой среде поглощение света,обладающего левой круговой поляризацией ( AL ), отличается от поглощенияправо-поляризованного света ( AR ). После прохождения через среду каждаясоставляющая остается по-прежнему поляризованной по кругу, но радиусыокружностей, описываемых электрическими векторами, теперь различаются. Этоявление называют круговым дихроизмом [116].При прохождении луча через слой вещества толщиной d плоскостьполяризации поворачивается на уголn L  n R  d,(2.11)где λ – длина волны падающего света, nL и nR – показатели преломления для левойи правой волн [117].В результате сложения противоположно поляризованных составляющихполучается эллиптически поляризованный свет, так как составляющие обладаютразными амплитудами.

КД измеряется путем попеременного пропускания черезобразец то лево-, то право поляризованного света и регистрации соответствующейразности поглощений  , которая является мерой величины КД. Величина ( AL  AR ). Эта разность может быть как положительной, так и отрицательной.C l36Спектр КД представляет собой зависимость разности коэффициентов поглощенийот длины волны. Величина  имеет большие значения только в узкой областичастот вблизи максимума поглощения хромофора.Оптически активные хромофоры делятся на два типа: к первому относятсяхромофоры, которые сами по себе уже являются асимметричными и обладаютоптической активностью, ко второму – хромофоры, которые становятсяоптически активными в результате асимметричного окружения. Этим окружениеммогут быть как собственные боковые группы, ковалентно связанные схромофором, так и другие атомы и молекулы, с которыми хромофорвзаимодействует, например, в силу того, что находится в комплексе сасимметричной (спиральной) молекулой ДНК.Подвлияниемструктурнойасимметриимакромолекулывозникаетасимметрия электронной оболочки хромофора лиганда, даже если свободныйлиганд оптически не активен.

Это явление носит название индуцированногокругового дихроизма (ИКД). Возникающий индуцированный КД сопряжен сдлинноволновыми полосами поглощения и вызван взаимодействием хромофоровлиганда с азотистыми основаниями ДНК и/или друг с другом. Взаимодействиеизолированного хромофора с азотистыми основаниями ДНК приводит кпоявлению индуцированного КД в виде одиночной отрицательной илиположительной полосы, ассоциированной с длинноволновой полосой спектрапоглощения хромофора лиганда. Взаимодействие же хромофоров связанных сДНК молекул лиганда между собой приводит к возникновению спектраиндуцированногоКДввидедвойнойполосыразныхзнаковравнойинтенсивности (ИКД экситонного типа) [118].Вклад в величину индуцированного КД вносят три основных эффекта [119]: 1.электронныевзаимодействиялигандасцентрамисвязываниямакромолекулы, что на спектре КД проявляется в виде положительного илиотрицательного спектра, совпадающего по форме со спектром поглощениялиганда,372.

магнитно-электрические и диполь - дипольные взаимодействия лиганда иоснований ДНК,3.  экситонные взаимодействия, которые зависят от расстояния междухромофорами и от геометрии молекул:а) экситонное взаимодействие хромофоров макромолекулы и лиганда приусловии, что их уровни близки между собой (при этом наблюдается спектрразного знака в полосе поглощения хромофоров макромолекулы и лиганда),б)экситонноевзаимодействиехромофоровсоседнихлигандов,расположенных асимметрично друг относительно друга (при этом наблюдаетсярасщепление в полосе лиганда на положительный и отрицательный спектр).Экситонное расщепление очень мало, его нелегко обнаружить при помощиобычных методов измерения поглощения.

КД значительно увеличивает этотэффект благодаря наличию полос противоположного знака.В некоторых случаях, когда основной вклад в ИКД вносит экситонноевзаимодействие хромофора лиганда и ближайших азотистых оснований ДНК,можно определить ориентацию молекулы лиганда на двойной спирали ДНК [23].Однакодляэтогонеобходимознатьнаправлениеполяризациивзаимодействующего электронного перехода хромофора [120].Величина индуцированного КД в полосе поглощения отражает свойстваисключительно связывающего вещества.

Это облегчает выявление эквивалентныхцентров связывания, а также определение количества связанных лигандов.Эти теории имеют, однако, довольно узкую область применения. Поэтомутрактовка полученных результатов представляет значительные трудности, аспектры КД используются, как правило, только для качественного определенияспособа связывания. Все выводы относительно конформации макромолекул,сделанные на основе спектрополяриметрических данных, необходимо проверятьдругими методами.Спектры КД были получены на дихрографе Mark-IV фирмы «Jobin-Yvon».Полученные электронные данные обрабатывались в программе Origin 8.0.Толщина кюветы 5 см.382.3.

Изотермическая калориметрияИзотермическое калориметрическое титрование (ИКТ) дает возможностьполучения изменения энтальпии ΔH практически для любой реакции связыванияпри фиксированной постоянной температуре. В зависимости от величиныконстанты связывания и растворимости реагентов, ИКТ может также бытьиспользованодляполученияизотермы,котораяпозволяетрассчитатьравновесную константу связывания (Ксв) и определить стехиометрию комплекса(количество мест связывания (n)). Поэтому, правильно проведенный эксперимент,может дать практически полный термодинамический профиль для реакциисвязывания в эксперименте. В случае ИКТ реакцию инициируют изменениемхимического состава образца посредством титрования исследуемым лигандом.Величина теплоты, связанной с реакцией (выделяемая или поглощаемая)фиксируется.Свободная энергия Гиббса для процесса взаимодействия при достиженииравновесия определяется стандартным термодинамическим соотношением:G   RT ln K a  RT ln K d  H   TS  ,гдеH  и S  –(2.12)изменения энтальпии и энтропии, соответственно, R –газоваяпостоянная, Т – абсолютная температура, Ка – константа связывания, Кd –константа диссоциации.Для неравновесных систем, изменение свободной энергии Гиббса: HL  ,G  G   RT ln H L Влияние температуры наG описываетсяT   CG T   H Tref следующим уравнением: p dT  TS Tref  TTrefгдеC p– изменение теплоемкости,Tref(2.13)T Cpdln T ,(2.14)Tref–начальная температура [121].Для реакции с одним типом независимых мест связывания, изменениетеплоты, связанное с изменением концентрации комплекса:dQ  d HL  H   V0 ,гдеH  –молярная энтальпия связывания, V0 – объем ячейки калориметра.(2.15)39Выразив концентрацию связанного лиганда через константу связывания иколичество мест связывания, получаемQ2NM t HV0   X t  1   X t 1   4X t , 11   NM t   NKM t NM t   NKM t  NM t  2  (2.16)где N – количество мест связывания, Mt – полная концентрация макромолекулы,Xt – полная концентрация лиганда,H– молярная энтальпия связывания, К –константа связывания [122].Для получения результата (изотермы), пригодного для обработки иполучения необходимой информации необходимо точно подобрать концентрациюДНК, концентрацию лиганда, полный объем инъектанта и объем каждойинъекции, время между инъекциями, а также температуру системы.